Die Autoren danken Dr. Karine Loulier für den Zugang zur transgenen Mauslinie MAGIC-Marker. Die Autoren danken auch der RAM-Neuro Animal Core Facility und der Imaging Facility MRI, einem Mitglied der nationalen Infrastruktur France-BioImaging, die von der französischen Nationalen Forschungsagentur unterstützt wird (ANR-10-INBS-04, "Investitionen für die Zukunft"). Diese Forschung wurde vom ATIP-Avenir-Programm, Inserm, der Region Okzitanien, der Universität Montpellier, der französischen Nationalen Forschungsagentur (ANR-21-CE17-0061), der Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140) und der Groupama-Stiftung unterstützt.

Alle Versuche wurden von der Nationalen Tierversuchsbehörde genehmigt.
1. Vorbereitungen
<ol><li>Bereiten Sie eine Anästhesielösung aus Ketamin-Xylazin für die Anästhesie vor. Injizieren Sie Ketamin mit 80 mg/kg und Xylazin mit 10 mg/kg, indem Sie 200 μl Ketamin (100 mg/ml) und 125 μl Xylazin (20 mg/ml) in 2.175 ml sterilem 0,9%igem NaCl verdünnen.</li>
	<li>Bereiten Sie 0,02 mg/ml Buprenorphinlösung als analgetische Lösung vor, indem Sie 100 μl 0,3 mg/ml Buprenorphin zu 1.400 ml sterilem 0,9%igem NaCl hinzufügen.</li>
	<li>Bereiten Sie die fluoreszierende Färbelösung vor.<ol><li>Mit einer feinen Waage werden 10 mg Fluoresceinsalz abgewogen und in 10 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt, um eine 0,1%ige Fluoresceinlösung zu erhalten.</li>
		<li>Schützen Sie die Lösung vor Licht und schütteln Sie sie 5 Minuten lang. Verwenden Sie eine 10-ml-Spritze und einen Spritzenfilter von 0,2 μm, um die Lösung zu filtrieren. HINWEIS: Die fluoreszierende Lösung muss vor Licht geschützt werden und kann 5 Tage lang bei +4 °C gelagert werden.</li>
	</ol></li>
	<li>Vorbereitung der Maus<ol><li>Wiegen Sie die Maus und leiten Sie eine Anästhesie ein, indem Sie eine intraperitoneale Injektion von 10 μl/g Mausgewicht (MW) der Anästhesielösung durchführen. Wenn sich die Maus nicht mehr bewegt, legen Sie sie auf eine beheizte Platte (37 °C) und überprüfen Sie, ob sie vollständig betäubt ist, indem Sie die Zehen zusammenkneifen.</li>
		<li>Tragen Sie einen Tropfen künstliche Träne auf das operierte Auge und einen Tropfen Augengel auf das kontralaterale Auge auf.</li>
		<li>Sobald die Maus nicht mehr auf das Kneifen reagiert, injizieren Sie die Analgesie (0,02 mg/ml Buprenorphin) mit 5 μl/g MW, um 0,1 mg/kg Buprenorphin subkutan in den Hals zu verabreichen.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Abrieb der Hornhaut
<ol><li>Befolgen Sie Schritt 1.3, um die fluoreszierende Färbelösung herzustellen.</li>
	<li>Führen Sie Schritt 1.4 aus, um die Maus vorzubereiten.</li>
	<li>Bevor Sie den Abrieb durchführen, tauchen Sie den Augenbohrer in 70% EtOH und dann in PBS, um ihn zu reinigen.</li>
	<li>Legen Sie die Maus auf eine erhitzte Platte (37 °C) an der Seite, um das zu operierende Auge leicht zu erreichen.<ol><li>Verwenden Sie ein Wattestäbchen, um die künstliche Träne aufzusaugen, und bürsten Sie die Wimpern weg, ohne das Auge zu berühren.</li>
		<li>Schalten Sie den Augenbohrer ein, öffnen Sie das Augenlid der Maus mit zwei Fingern und blockieren Sie gleichzeitig die Vibrissen, um zu verhindern, dass sie im Grat stecken bleiben.</li>
	</ol></li>
	<li>Lokalisieren Sie die Pupille oder die Mitte des Auges und legen Sie den Augenbohrer auf die Oberfläche des Auges und machen Sie kreisende Bewegungen. Bei genauem Hinsehen kann die Oberfläche des entfernten Epithels beobachtet werden. Ansonsten machen Sie ca. 20 kreisende Bewegungen auf der Hornhaut.</li>
	<li>Legen Sie die Maus wieder auf den Bauch und prüfen Sie, ob das Augengel noch im kontralateralen Auge vorhanden ist.</li>
	<li>Tragen Sie einen Tropfen Fluoreszenz-Färbelösung auf das abgeriebene Auge auf und warten Sie 20 Sekunden. Nehmen Sie den Tropfen mit einem Taschentuch auf, ohne das Auge zu berühren, und spülen Sie ihn mit einem Tropfen künstlicher Träne aus. Nehmen Sie den Tropfen der künstlichen Träne mit einem Taschentuch auf und beleuchten Sie das Auge mit der blauen Kobaltlampe. HINWEIS: Der Abrieb muss eine kreisförmige Form haben. Es erfordert eine gewisse Schulung, um es zu erhalten.</li>
	<li>Tragen Sie einen Tropfen Augengel auf das abgeriebene Auge auf und lassen Sie die Maus auf dem beheizten Pad aufwachen. Wenn sich die Maus von selbst bewegt, setzen Sie sie wieder in ihren Käfig.</li>
	<li>Kontrollieren Sie das Wohlbefinden des Tieres in den folgenden 2 Tagen.</li>
	<li>Verwenden Sie nach der Verwendung des Augenbohrers ein weiches Gewebe, um Epithelzellen zu entfernen, die im Kopf des Bohrers stecken, und tauchen Sie ihn in 70% EtOH und dann in PBS. HINWEIS: Sobald die Epithelzellen mit dem Weichgewebe entfernt wurden, stellen Sie sicher, dass keine Gewebestücke im Kopf des Fräsers stecken bleiben.</li>
</ol>3. Axotomie der Hornhautnerven
<ol><li>Führen Sie Schritt 1.4 aus, um die Maus vorzubereiten.</li>
	<li>Legen Sie die Maus unter eine Binokularlupe an der Seite, um an das Auge zu gelangen, das sich der Operation unterzieht. Lege den Boden einer Petrischale unter den Kopf der Maus, so dass das Auge waagerecht ist. HINWEIS: Die folgenden Schritte werden durchgeführt, indem Sie durch die Fernlupe schauen.</li>
	<li>Entfernen Sie die künstliche Träne mit einem Wattestäbchen und entfernen Sie die Wimpern, ohne das Auge zu berühren.</li>
	<li>Lege eine glatte, gebogene Zange unter das Auge des Tieres, um es aus der Augenhöhle herauszuholen. Achten Sie darauf, die Zange so weit zu schließen, dass das Auge nicht mehr in die Augenhöhle zurückkehren kann, sobald Druck ausgeübt wird, aber nicht übermäßig, um eine Schädigung des Sehnervs zu vermeiden.</li>
	<li>Wenden Sie die Biopsienstanze von 2,5 mm senkrecht ohne Druck auf das Auge an, um einen vollständigen Kontakt der Stanze mit der Oberfläche der Hornhaut zu gewährleisten. HINWEIS: Sobald der Schlag auf die Hornhaut angewendet wird, kann die Hand des Versuchsleiters das Sichtfeld stören.</li>
	<li>Beginnen Sie dann, Druck auszuüben und drehen Sie den Stempel mehrmals. HINWEIS: Je nach Druck kann die Anzahl der Drehungen variieren, aber im Allgemeinen liegt sie bei etwa 5. Es erfordert Training, um den richtigen Druck und die richtige Bewegung zu spüren. Wird zu viel Druck ausgeübt, reißt das Auge. In diesem Fall kann beobachtet werden, dass Flüssigkeit aus der Läsion austritt und das Auge weich wird. Das Tier muss geopfert werden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Biopsiestanze. Auf der Hornhaut muss ein Kreis sichtbar sein, an dem der Biopsiestanzer angelegt wurde. HINWEIS: Für die nächsten Schritte ist die Binokularlupe nicht erforderlich.</li>
	<li>Prüfen Sie, ob das kontralaterale Auge noch Augengel hat, und tragen Sie etwas davon auf das axotomisierte Auge auf.</li>
	<li>Lassen Sie die Maus auf einem beheizten Pad (37 °C) aufwachen und setzen Sie sie wieder in ihren Käfig, wenn sie sich selbstständig bewegt.</li>
	<li>Kontrollieren Sie das Wohlbefinden des Tieres in den folgenden 2 Tagen.</li>
</ol>4. Hornhaut-Whole-Mount-Verarbeitung
<ol><li>Probenentnahme und -fixierung.<ol><li>Wiegen Sie die Maus und leiten Sie eine Anästhesie ein, indem Sie eine intraperitoneale Injektion von 10 μl/g Mausgewicht (MW) der Anästhesielösung durchführen.</li>
		<li>Wenn sich die Maus nicht mehr bewegt und keine Reflexe durch Einklemmen der Zehen hat, führen Sie eine zervikale Luxation durch.</li>
		<li>Heben Sie das Auge mit zwei Fingern aus der Augenhöhle und enukleieren Sie das Auge, indem Sie den Sehnerv mit einer gebogenen Schere durchtrennen.</li>
		<li>Legen Sie das Auge in ein 2-ml-Plastikröhrchen, das PBS enthält.</li>
		<li>Fixieren Sie das Auge, indem Sie das PBS durch 4% Paraformaldehyd ersetzen und es 20 Minuten lang bei Raumtemperatur (RT) auf einen Shaker (30 U/min) legen.</li>
		<li>3 Mal 10 min mit PBS bei RT auf einem Shaker (30 U/min) spülen.</li>
	</ol></li>
	<li>Präparation der Hornhaut<ol><li>Geben Sie einen Tropfen PBS auf ein Stück Parafilm in einer Petrischale.</li>
		<li>Legen Sie das Auge in diesen Tropfen PBS.</li>
		<li>Platzieren Sie die Petrischale unter der Binokularlupe.</li>
		<li>Präparieren Sie die Hornhaut mit einer Mikropräparierschere und einer Pinzette. Oberhalb des Ziliarkörpers schneiden, um den Limbus zu halten.</li>
		<li>Entfernen Sie die Linse, den Ziliarkörper und die Iris mit einer feinen Pinzette.</li>
		<li>Legen Sie die Hornhaut wieder in ein 2-ml-Kunststoffröhrchen.</li>
	</ol></li>
	<li>Immunfluoreszenz-Protokoll<ol><li>Inkubieren Sie die Hornhaut in 2 ml 2,5 % Fischhautgelatine, 5 % Ziegenserum und 0,5 % Detergens in PBS für 1 h bei RT auf einem Schüttler (30 U/min).</li>
		<li>Die Hornhaut wird in 150 μl einer Lösung aus 2,5 % Fischhautgelatine, 5 % Ziegenserum und 0,1 % Detergens in PBS mit dem auf 1/1000 verdünnten Primärantikörper (Anti-βIII-Tubulin-Antikörper) über Nacht bei 4 °C auf einem Schüttler (30 U/min) inkubiert.</li>
		<li>3 Mal 1 h lang mit 0,1 % Reinigungsmittel in PBS bei RT auf einem Shaker (30 U/min) spülen.</li>
		<li>Die Hornhaut wird in derselben Lösung wie in Schritt 4.3.2 inkubiert, wobei der Sekundärantikörper über Nacht bei 4 °C auf einem Schüttler (30 U/min) mit 1/500 verdünnt wurde.</li>
		<li>3 Mal 1 h lang mit PBS bei RT auf einem Shaker (30 U/min) spülen.</li>
		<li>Die Hornhaut wird 10 Minuten lang mit 150 μl DNA-Interkalator, verdünnt bei 1/5000 bei RT auf einem Schüttler (30 U/min) inkubiert.</li>
		<li>2 mal 5 min mit PBS ausspülen.</li>
	</ol></li>
	<li>Befestigung der Hornhaut<ol><li>Legen Sie die Hornhaut auf einen Objektträger, das Epithel zeigt zum Objektträger, und erstellen Sie mit einem Skalpell vier Abschnitte, ohne die Mitte zu erreichen. HINWEIS: Führen Sie die Abschnitte gegenüberliegend aus, um eine Blumenform zu bilden.</li>
		<li>Legen Sie das Hornhautendothel in Richtung des Objektträgers und entfernen Sie das PBS um die Hornhaut herum mit einem Taschentuch. HINWEIS: Entfernen Sie das PBS nicht unter der Hornhaut; Andernfalls kann es zu Luftblasen kommen. Wenn ja, geben Sie PBS auf die Hornhaut und entfernen Sie die Luftblase. Starten Sie dann mit Schritt 4.3.2 neu.</li>
		<li>Tragen Sie Modellpaste auf die vier Ecken eines rechteckigen Deckglases auf. HINWEIS: Die Modellpaste hebt das Deckglas an, da die Hornhaut ein dickes Gewebe ist.</li>
		<li>Tropfen Sie 50 μl eines Eindeckmediums auf die Hornhaut und legen Sie das Deckglas vorsichtig darüber, um Blasenbildung zu vermeiden.</li>
		<li>Versiegeln Sie das Deckglas mit Nagellack.</li>
	</ol></li>
	<li>Bildgebung<ol><li>Legen Sie den Objektträger unter ein Epifluoreszenzmikroskop.</li>
		<li>Definieren Sie die Größe des Mosaiks und die Tiefe des Bildes und starten Sie die Aufnahme.</li>
		<li>Wenden Sie ein Entschärfungs- und Entfaltungsprogramm auf das aufgenommene Bild an. HINWEIS: Schritt 4.6.3 ist eine Option, die in der Erfassungssoftware ausgewählt wurde (Large Volume Computational Clearing [LVCC])</li>
	</ol></li>
</ol>5. Lokalisierte Laserablation von Hornhautnerven
<ol><li>Schalten Sie das aufrechte Multiphotonenmikroskop und den Laser in Kombination mit einem optisch-parametrischen Oszillator ein. Aktivieren Sie den beheizten Tisch des Mikroskops (37 °C) und stellen Sie die Laser auf 850 nm und 1100 nm ein, entsprechend den für das Mausmodell erforderlichen Wellenlängen.</li>
	<li>Stellen Sie mit einem Leistungsmesser die Leistung der Laser gleichzeitig auf etwa 20 mW ein.</li>
	<li>Befolgen Sie Schritt 1.4, um die Maus vorzubereiten und tragen Sie Augengel auf beide Augen auf. HINWEIS: Das für dieses Protokoll verwendete Tier muss aus einer transgenen Mauslinie (MAGIC-Marker transgene Maus21) stammen, die ein endogenes Fluorophor in den Hornhautnervenfasern exprimiert.</li>
	<li>Setzen Sie das Tier in eine Kopfhalterung ein. Drehen Sie das Tier um 90°, damit das Auge des Interesses zur Decke zeigt.</li>
	<li>Schnallen Sie die Vibrissen des Tieres um, um die Augenpartie zu reinigen. Schnallen Sie den Körper des Tieres an, um die durch die Atmung verursachte Kopfbewegung zu verringern.</li>
	<li>Legen Sie ein kreisförmiges Deckglas auf das Auge über dem Augengel. Das Deckglas muss waagerecht sein. Zögern Sie nicht, den Kopf des Tieres zu bewegen, damit das Deckglas richtig positioniert wird.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen PBS über das Deckglas. Legen Sie das Tier vorsichtig auf den Mikroskoptisch und stellen Sie den Objektivrevolver im richtigen Abstand ein.</li>
	<li>Verwenden Sie das wässrige 20x-Objektiv und die Epifluoreszenz, um das Auge und die Innervation durch das Okular zu lokalisieren.</li>
	<li>Aktivieren Sie die Laser und definieren Sie die Tiefe, die beleuchtet werden soll.</li>
	<li>Erfassen Sie ein Bild mit einer Auflösung von 1024 x 1024 (Pixeln) bei einer Aufnahmegeschwindigkeit von 70 % bis 85 % der maximalen Scangeschwindigkeit.</li>
	<li>Sobald das Bild aufgenommen ist, nehmen Sie das Tier vom Mikroskop und entfernen Sie das Deckglas und die Gurte. Nehmen Sie das Tier aus der Kopfhalterung, fügen Sie bei Bedarf mehr Augengel hinzu und lassen Sie es in einem Käfig auf einer beheizten Platte aufwachen. HINWEIS: Die Zerstörung der Innervation kann 1 Woche nach der Bildgebung beobachtet werden. Dieses Protokoll kann über mehrere Wochen einmal pro Woche wiederholt werden, um den durch die Laser verursachten Schaden zu erhöhen.</li>
	<li>Wenn sich das Tier von alleine bewegt, stellen Sie den Käfig zurück in den Stall und überprüfen Sie sein Wohlbefinden für die folgenden 2 Tage.</li>
</ol>

Protokolle zur Schädigung von sensorischen Fasern der Hornhaut für Studien zur Axonregeneration

<ol>
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Neurotrophe Keratitis gilt als seltene Erkrankung, von der 5 von 10.000 Personen betroffen sind. Menschen, die aufgrund einer körperlichen Verletzung wie Verätzungen oder Syndromen wie Diabetes oder Multipler Sklerose an NK leiden, sind jedoch nicht in dieser Statistik enthalten3. Darüber hinaus wird diese Erkrankung nach wie vor deutlich unterdiagnostiziert22 und die Prävalenz der Krankheit unterschätzt. Es besteht ein großer Bedarf an neuen Behandlungen und Therapie...

Die Hornhaut, die transparente Oberfläche des Auges, besteht aus drei verschiedenen Schichten: dem Epithel, dem Stroma und dem Endothel. Dieses Organ hat die höchste Innervationsdichte im Körper und besteht hauptsächlich aus sensorischen Fasern (Typen Aδ und C), die aus dem ophthalmologischen Ast des Trigeminusganglions stammen. Sensorische Fasern dringen in Form von großen Bündeln in die Peripherie der Hornhaut im mittleren Stroma ein, die sich verzweigen, um die Oberfläche zu bedecken. Sie verzweigen sich dann, um die Bowmann-Membran zu durchstoßen und den subbasalen Plexus zu bilden, der leicht an der Bildung eines Wirbels in der Mitte der Hornhaut zu erkennen ist. Diese Fasern enden als freie Nervenenden an der äußeren Oberfläche des Epithels. Sie sind in der Lage, thermische, mechanische und chemische Reize zu transduzieren und trophische Faktoren freizusetzen, die für die Epithelhomöostase essentiell sind 1,2. Die neurotrophe Keratitis (NK) ist eine degenerative Erkrankung, die die sensorische Innervation der Hornhaut betrifft. Diese seltene Krankheit beruht auf einer Abnahme oder einem Verlust der Hornhautempfindlichkeit, die zu einer geringeren Tränenproduktion und schlechten Heilungseigenschaften der Hornhaut führt3. NK durchläuft drei gut beschriebene Stadien, von Stadium 1, in dem die Patienten Epitheldefekte erleiden, bis Stadium 3, in dem stromales Schmelzen und/oder Hornhautperforation auftreten4.
Klinisch können die Ursprünge dieser Erkrankung vielfältig sein. Patienten können die Hornhautinnervation nach körperlichen Verletzungen des Auges, Operationen oder durch chronische Erkrankungen wie Diabetes verlieren 5,6. Bis heute ist der Prozess der NK-Pathogenese nur unzureichend verstanden, und die therapeutischen Möglichkeiten für diese Sehkraft bedrohende Erkrankung sind sehr begrenzt. Daher ist ein besseres Verständnis der Eigenschaften von Epitheldefekten erforderlich, um die Mechanismen hinter der Regeneration dieser Fasern besser zu verstehen und sie möglicherweise zu fördern. Hier schlagen wir verschiedene Modelle von Hornhautverletzungen vor, die NK bei Mäusen induzieren.
Das erste Modell ist der Abrieb der Epithelschicht der Hornhaut mit einem Augenbohrer. Dieses Modell wurde hauptsächlich im Zusammenhang mit der Regeneration des Epithels bei verschiedenen Tieren, wie Nagetieren und Fischen untersucht 7,8,9 und um Moleküle zu testen, die die Hornhautheilung fördern10,11. Physiologisch dauert es 2-3 Tage, bis die Epithelzellen die Wunde verschlossen haben. Das physiologische Muster der Innervation benötigt jedoch mehr als vier Wochen, um sich von der Abrasion zu erholen 12,13. Während der Operation entfernt der Augenbohrer die Epithelschicht der Hornhaut, die den subbasalen Plexus und die freien Nervenenden der Fasern enthält. Dieses Verfahren kann klinisch mit Patienten mit photorefraktiver Keratektomie (PRK) zur Korrektur von Augenrefraktionsdefekten verglichen werden. Das Verfahren besteht darin, das Epithel der Hornhaut zu entfernen und dann das Stroma mit einem Laser14 umzuformen. Nach einer solchen Operation können verschiedene Nebenwirkungen auftreten, wie z. B. eine Abnahme der Hornhautnervendichte für 2 Jahre und eine Verringerung der Empfindlichkeit für einen Zeitraum von 3 Monaten bis zu einem Jahr nach der Operation15. Angesichts der Tatsache, dass die Operation eine Fragilität der Hornhautmikroumgebung induziert, könnte dieses Modell dazu beitragen, diese Nebenwirkungen zu untersuchen und therapeutische Ansätze zu entwickeln, die eine schnellere Reinnervation fördern und so die betreffenden Nebenwirkungen reduzieren.
Das zweite Modell besteht darin, die Axone an der Peripherie der Hornhaut mit einer Biopstanze zu durchtrennen, wodurch eine Wallersche Degeneration der zentralen Innervation induziert wird 16. Klinisch könnte diese Methode mit der vorderen lamellären Keratoplastik verglichen werden, bei der der Chirurg eine partielle Trepanation der Hornhaut durchführt, um einen Teil der vorderen Dicke der Hornhaut zu entfernen und durch ein Spendertransplantat zu ersetzen 17. Nach einer lamellären Keratoplastik können die Patienten unter einer Reihe von Symptomen leiden, darunter trockene Augen, Verlust der Hornhautinnervation und Transplantatabstoßung18. Dieses Axotomiemodell, das an Hornhautnerven durchgeführt wird, könnte einen Einblick in die Mechanismen der Faserdegeneration geben, die nach einer Transplantation und anschließender Regeneration der Axone auftritt.
Bei der dritten Methode werden die Hornhautnerven mit einem Laser geschädigt. Durch die Verwendung eines Multiphotonenmikroskops auf der Hornhaut von anästhesierten Tieren wird eine Degeneration der im optischen Feld lokalisierten Nerven als Folge der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) induziert, was zu DNA-Schäden und zellulärer Kavitation führt19. Diese Methode rekapituliert die Lichtschädigung der Hornhaut, die durch übermäßige Exposition gegenüber natürlichem UV-Licht (Sonnenbrand) verursacht wird, was auch die Bildung von ROS auslöst, was zu DNA-Schäden führt20. Patienten, die an einem Hornhautsonnenbrand leiden, leiden unter großen Schmerzen, da durch den Abbau der Epithelzellen die Extremitäten der Hornhautfasern vollständig entzogen werden.
Die drei hier beschriebenen Methoden sollen die Untersuchung des NK-Pathogeneseprozesses und der Axonregeneration ermöglichen. Sie sind leicht reproduzierbar und präzise. Darüber hinaus ermöglichen sie eine schnelle Genesung und eine einfache Überwachung der Tiere.

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		<tr>
			<td>0.2 &#181;m seringe filter</td>
			<td>CLEARLINE</td>
			<td>51733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm rust ring remover</td>
			<td>Alger Equipment Company</td>
			<td>BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendrof&#160;</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td>Alger Equipment Company</td>
			<td>BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta III Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigenfix</td>
			<td>Diapath</td>
			<td>P0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tear</td>
			<td>Larmes artificielles Martinet</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprecare</td>
			<td>Animalcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Any provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SGM 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated plate</td>
			<td>BIOSEB LAB instruments</td>
			<td>BIO-HE002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene 1000</td>
			<td>BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France</td>
			<td>N/A</td>
			<td>French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Large volume computational clearing (LVCC) process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Chameleon Ultra II</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser power meter</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder Imager Tissue microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td>TVM lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parametric oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penlights with blue cobalt filtercap</td>
			<td>Bernell</td>
			<td>ALPEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>Axotomy protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td>Cornea whole-mount processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2%</td>
			<td>Elanco</td>
			<td>N/A</td>
			<td>French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile biopsy punch 2.5 mm</td>
			<td>LCH medical</td>
			<td>LCH-PUK-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>EuroBioSciences</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
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three strategies to induce neurotrophic keratitis and nerve regeneration in murine cornea

Die Hornhaut ist ein transparentes Gewebe, das das Auge bedeckt und für eine klare Sicht entscheidend ist. Es ist das am stärksten innervierte Gewebe im Körper. Diese Innervation sorgt für Empfindung und trophische Funktion des Auges und trägt zur Erhaltung der Hornhautintegrität bei. Die krankhafte Störung dieser Innervation wird als neurotrophe Keratitis bezeichnet. Dies kann durch eine Verletzung des Auges, eine Operation oder eine Krankheit ausgelöst werden. In dieser Studie schlagen wir drei verschiedene Protokolle vor, um die Innervation auf eine Weise zu schädigen, die die drei Arten von Fällen rekapituliert, die im Allgemeinen in der Klinik auftreten.
Die erste Methode besteht darin, das Epithel mit einem ophthalmologischen Bohrer abzureiben. Dabei werden die Epithelschicht, die freien Nervenenden und der subbasale Plexus ähnlich wie bei der in der Klinik durchgeführten photorefraktiven Keratektomie entfernt. Die zweite Methode zielt nur auf die Innervation ab, indem sie an der Peripherie mit einer Biopsienstanze durchtrennt wird, um die Integrität des Epithels zu erhalten. Diese Methode ähnelt den ersten Schritten der lamellären Keratoplastik und führt zu einer Degeneration der Innervation mit anschließendem Nachwachsen der Axone in der zentralen Hornhaut. Die letzte Methode schädigt die Innervation eines transgenen Mausmodells mit Hilfe eines Multiphotonenmikroskops, das spezifisch den Ort der Kauterisierung der fluoreszierenden Nervenfasern lokalisiert. Diese Methode verursacht den gleichen Schaden wie eine Photokeratitis, eine übermäßige Bestrahlung mit UV-Licht.
Diese Studie beschreibt verschiedene Möglichkeiten zur Untersuchung der Physiopathologie der Hornhautinnervation, insbesondere der Degeneration und Regeneration der Axone. Die Förderung der Regeneration ist entscheidend, um Komplikationen wie Epitheldefekte oder sogar Perforationen der Hornhaut zu vermeiden. Die vorgeschlagenen Modelle können dabei helfen, neue pharmakologische Moleküle oder Gentherapien zu testen, die die Nervenregeneration verbessern und das Fortschreiten der Krankheit begrenzen.

The cornea, which is the transparent surface of the eye, is composed of three distinct layers: the epithelium, the stroma, and the endothelium. This organ has the highest density of innervation in the body and is composed mainly of sensory fibers (types A&#948; and C) originating from the ophthalmic branch of the trigeminal ganglion. Sensory fibers penetrate the periphery of the cornea in the mid-stroma in the form of big bundles that branch out to cover the surface. They then bifurcate to pierce the Bowmann&#39;s membrane and form the subbasal plexus, which is easily recognizable by the formation of a vortex in the center of the cornea. Those fibers terminate as free nerve endings at the external surface of the epithelium. They are able to transduce thermal, mechanical, and chemical stimuli and to release trophic factors that are essential for epithelium homeostasis1,2. Neurotrophic keratitis (NK) is a degenerative disease affecting the corneal sensory innervation. This rare disease stems from a decrease or a loss of corneal sensitivity that results in lower tear production and poor healing properties of the cornea3. NK progresses through three well-described stages, from stage 1 where patients suffer epithelial defects, to stage 3 where stromal melting and/or corneal perforation occur4.
Clinically, the origins of this disease can be diverse. Patients can lose corneal innervation after physical injury to the eye, surgery, or through chronic diseases, such as diabetes5,6. To date, the NK pathogenesis process remains poorly understood, and therapeutical options for this sight-threatening condition are very limited. Therefore, a better understanding of the characteristics of epithelial defects is needed to better understand the mechanisms behind the regeneration of those fibers and potentially promote them. Here, we propose several models of corneal injury that induce NK in mice.
The first model is the abrasion of the epithelial layer of the cornea with an ocular burr. This model has mainly been studied in the context of the regeneration of the epithelium in different animals, such as rodents and fish7,8,9, and to test molecules promoting corneal healing10,11. Physiologically, it takes 2-3 days for the epithelial cells to close the wound. The physiological pattern of the innervation, however, takes more than four weeks to recover from the abrasion12,13. During the surgery, the ocular burr removes the epithelial layer of the cornea that contains the subbasal plexus and the fibers&#39; free nerve endings. This procedure can be clinically compared to patients with photorefractive keratectomy (PRK) to correct eye refractive defects. The procedure consists of removing the epithelium of the cornea and then reshaping the stroma with a laser14. Patients can experience several side effects following such surgery, such as a decrease of corneal nerve density for 2 years and a reduction in sensitivity for a duration of 3 months to one year post-surgery15. Given that the surgery induces a fragility of the corneal microenvironment, this model could help investigate these side effects and develop therapeutical approaches that would promote faster reinnervation, thus reducing the side effects in question.
The second model consists of sectioning the axons at the periphery of the cornea with a biopsy punch, inducing a Wallerian degeneration of the central innervation 16. Clinically, this method could be compared to anterior lamellar keratoplasty, in which the surgeon realizes a partial trephination of the cornea to remove a part of the anterior thickness of the cornea and replace it with a donor transplant 17. Following lamellar keratoplasty, patients may suffer from a number of symptoms including dry eye, loss of corneal innervation and graft rejection18. This axotomy model performed on corneal nerves could provide insight into the mechanisms of fiber degeneration, which occurs after a graft, followed by the axons&#39; regeneration.
The third method damages the corneal nerves with a laser. By using a multiphoton microscope on the cornea of anesthetized animals, degeneration of the nerves localized in the optical field is induced as a result of reactive oxygen species (ROS) formation, which leads to DNA damage and cellular cavitation19. This method recapitulates the corneal photodamage induced by overexposure to natural UV (sunburn), which also triggers ROS formation, leading to DNA damage20. Patients who suffer from corneal sunburn experience great pain, as the deterioration of epithelial cells deprives the corneal fibers&#39; extremities of all.
The three methods described here are designed to enable the investigation of the NK pathogenesis process and axon regeneration. They are easily reproducible and precise. Moreover, they allow quick recovery and easy monitoring of the animals.

Autor im Rampenlicht: Förderung der Hornhautinnervationsforschung durch innovative Modelle 

Drei Strategien zur Induktion von neurotropher Keratitis und Nervenregeneration in der murinen Hornhaut

Diese Studie schlägt mehrere Protokolle vor, um die Hornhautinnervation bei Mäusen zu schädigen. Während ähnliche Protokolle verwendet wurden, um die Physiopathologie der Heilung des Epithels zu untersuchen, haben wir uns entschieden, neue Methoden zur Untersuchung der Regeneration der Hornhautinnervation anzupassen und zu entwickeln. Um die Innervation zu beobachten, haben wir zwei Techniken verwendet. Zunächst verwendeten wir eine Immunfluoreszenztechnik, um die Nervenfasern mit einem panneuronalen Antikörper (B...

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Hier schlagen wir drei verschiedene Methoden vor, um die sensorischen Fasern, die die Hornhaut innervieren, zu schädigen. Diese Methoden erleichtern die Untersuchung der Axonregeneration bei Mäusen. Diese drei Methoden, die auf andere Tiermodelle adaptierbar sind, sind ideal für die Untersuchung der Physiologie und Regeneration der Hornhautinnervation.

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation ...

Die Hornhaut, das transparente Gewebe, das das Auge bedeckt, benötigt eine ausgewogene Mikroumgebung, um ihre Integrität zu erhalten. Die dichte Innervation der Hornhaut ist an dieser Mikroumgebung beteiligt. Wenn es zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust dieser Innervation kommt, tritt ein spezifischer Zustand auf, der als neurotrophe Keratitis bezeichnet wird.Um neue Heilmittel und wirksame Heilmittel für diese Krankheit zu finden, brauchen wir spezifische Modelle. Die Ausweitung des Einsatzes transgener tiertragender fluoreszierender Reporter und mikroskopische Fortschritte haben neue Möglichkeiten zur Visualisierung der axonären Generierung eröffnet. In vivo Imagine ist für jedes Forschungslabor, das bereit ist, den Neurogenerationsprozess zu verfolgen, zugänglicher geworden.Die verschiedenen Ursachen, die eine neurotrophe Keratitis hervorrufen, liegen den Schwierigkeiten zugrunde, nur ein Modell zum Testen von Nervenregenerationstherapien zu haben. Diese drei Modelle reproduzieren verschiedene Situationen, die in Kliniken beobachtet werden, und der Austausch dieser Methoden wird es anderen Laboren ermöglichen, neue Aspekte der Hornhautinnervation aufzudecken, aus denen innovative Behandlungen entwickelt werden.

three-strategies-to-induce-neurotrophic-keratitis-nerve-regeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea

1.1K Aufrufe.  University of  Montpellier, INSERM. Die Hornhaut, das transparente Gewebe, das das Auge bedeckt, benötigt eine ausgewogene Mikroumgebung, um ihre Integrität zu erhalten. Die dichte Innervation der Hornhaut ist an dieser Mikroumgebung beteiligt. Wenn es zu einem teilweisen oder vollständigen Verlust dieser Innervation kommt, tritt ein spezifischer Zustand auf, der als neurotrophe Keratitis bezeichnet wird.Um neue Heilmittel und wirksame Heilmittel für diese Krankheit zu finden, brauchen wir spezifische Modelle. Die Au...

Serie: Autor im Rampenlicht: Förderung der Hornhautinnervationsforschung durch innovative Modelle 

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation provides sensation and trophic function to the eye and contributes to preserving corneal integrity. The pathological disruption of this innervation is termed neurotrophic keratitis. This can be triggered by injury to the eye, surgery, or disease. In this study, we propose three different protocols for inflicting damage on the innervation in ways that recapitulate the three types of cases generally encountered in the clinic.
The first method consists in making an abrasion of the epithelium with an ophthalmic burr. This involves the removal of the epithelial layer, the free nerve endings, and the subbasal plexus in a manner similar to the photorefractive keratectomy surgery performed in the clinic. The second method&#160;only targets the innervation by sectioning it at the periphery with a biopsy punch, maintaining the integrity of the epithelium. This method is similar to the first steps of lamellar keratoplasty and leads to a degeneration of the innervation followed by regrowth of the axons in the central cornea. The last method damages the innervation of a transgenic mouse model using a multiphoton microscope, which specifically localizes the site of cauterization of the fluorescent nerve fibers. This method inflicts the same damage as photokeratitis, an overexposure to UV light.
This study describes different options for investigating the physiopathology of corneal innervation, particularly the degeneration and regeneration of the axons. Promoting regeneration is crucial for avoiding such complications as epithelium defects or even perforation of the cornea. The proposed models can help test new pharmacological molecules or gene therapy that enhance nerve regeneration and limit disease progression.

Here, we propose three different methods of damaging the sensory fibres innervating the cornea. These methods facilitate the study of axon regeneration in mice. These three methods, which are adaptable to other animal models, are ideal for the study of corneal innervation physiology and regeneration.