המחברים מודים לד"ר קארין לולייה על הגישה לקו העכבר המהונדס MAGIC-Markers. המחברים מודים גם למתקן הליבה של בעלי החיים RAM-Neuro ולמתקן ההדמיה MRI, חבר בתשתית הלאומית צרפת-BioImaging הנתמכת על ידי סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-10-INBS-04, "השקעות לעתיד"). מחקר זה נתמך על ידי תוכנית ATIP-Avenir, Inserm, Région Occitanie, אוניברסיטת מונפלייה, סוכנות המחקר הלאומית הצרפתית (ANR-21-CE17-0061), Fondation pour la Recherche Médicale (FRM Regenerative Medicine, REP202110014140), וקרן Groupama.

כל הניסויים אושרו על ידי המועצה הלאומית לניסויים בבעלי חיים.
1. הכנות
<ol><li>הכינו תמיסת הרדמה של קטמין-קסילזין להרדמה. הזריקו קטמין ב-80 מ"ג/ק"ג וקסילזין ב-10 מ"ג/ק"ג על ידי דילול 200 מיקרוליטר קטמין (100 מ"ג/מ"ל) ו-125 מיקרוליטר קסילזין (20 מ"ג/מ"ל) ב-2,175 מ"ל של 0.9% NaCl סטרילי.</li>
	<li>הכינו תמיסת בופרנורפין 0.02 מ"ג/מ"ל כתמיסה משככת כאבים על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של 0.3 מ"ג/מ"ל בופרנורפין ל-1,400 מ"ל של 0.9% NaCl סטרילי.</li>
	<li>הכינו את תמיסת הצביעה הפלואורסצנטית.<ol><li>השתמש במשקל עדין כדי לשקול 10 מ"ג של מלח פלואורסצאין ולדלל אותו ב -10 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי לקבל תמיסת פלואורסצאין 0.1%.</li>
		<li>הגן על התמיסה מפני האור ונער אותה במשך 5 דקות. השתמש מזרק 10 מ"ל מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר כדי לסנן את הפתרון. הערה: התמיסה הפלואורסצנטית צריכה להיות מוגנת מפני האור וניתן לאחסן אותה ב +4 ° C למשך 5 ימים.</li>
	</ol></li>
	<li>הכנת העכבר<ol><li>משקל העכבר והשראת הרדמה על ידי ביצוע הזרקה תוך צפקית של 10 μL/g של משקל עכבר (MW) של תמיסת ההרדמה. כאשר העכבר מפסיק לנוע, הניחו אותו על צלחת מחוממת (37°C) וודאו שהוא מורדם לחלוטין על ידי צביטת אצבעות רגליו.</li>
		<li>יש למרוח טיפת דמעה מלאכותית על העין העוברת את הניתוח וטיפת ג'ל עיני על העין הנגדית.</li>
		<li>ברגע שהעכבר אינו מגיב לצביטה, הזריקו את משככי הכאבים (0.02 מ"ג / מ"ל בופרנורפין) ב 5 מיקרוליטר / גרם של MW כדי לספק 0.1 מ"ג / ק"ג buprenorphine תת עורית בצוואר.</li>
	</ol></li>
</ol>2. שחיקה של הקרנית
<ol><li>בצע את שלב 1.3 כדי להכין את תמיסת הצביעה הפלואורסצנטית.</li>
	<li>בצע את שלב 1.4 כדי להכין את העכבר.</li>
	<li>לפני ביצוע השחיקה, טבלו את בור העין ב-70% EtOH ולאחר מכן ב-PBS כדי לנקות אותו.</li>
	<li>הניחו את העכבר על צלחת מחוממת (37°C) בצד כדי לגשת בקלות לעין העוברת את הניתוח.<ol><li>השתמשו בצמר גפן כדי לספוג את הדמעה המלאכותית ולהבריש את הריסים מבלי לגעת בעין.</li>
		<li>הפעל את בור העין, פתח את עפעף העכבר בשתי אצבעות, ובו זמנית לחסום את הוויבריסה כדי למנוע מהם להיתקע לתוך הבור.</li>
	</ol></li>
	<li>למקם את האישון או את מרכז העין ולהחיל את בור העין על פני העין, ולעשות תנועות מעגליות. על ידי התבוננות מקרוב, פני השטח של אפיתל שהוסר ניתן לראות. אחרת, לעשות בערך 20 תנועות מעגליות על הקרנית.</li>
	<li>החזירו את העכבר לבטנו ובדקו אם ג'ל העין עדיין קיים בעין הנגדית.</li>
	<li>יש למרוח טיפה של תמיסת כתמים פלואורסצנטית על העין הנטועה ולהמתין 20 שניות. יש לספוג את הטיפה עם טישו מבלי לגעת בעין ולשטוף אותה בטיפת דמעה מלאכותית. לספוג את טיפת הדמעה המלאכותית עם רקמה ולהאיר את העין עם מנורת קובלט כחולה. הערה: השחיקה חייבת להיות בעלת צורה מעגלית. זה דורש קצת הכשרה כדי להשיג את זה.</li>
	<li>החל טיפה של ג'ל העין abraded ולתת העכבר להתעורר על כרית מחוממת. כאשר העכבר נע בכוחות עצמו, החזירו אותו לכלוב שלו.</li>
	<li>בדוק את רווחתו של בעל החיים במהלך היומיים הבאים.</li>
	<li>לאחר השימוש בבור העין, השתמש ברקמה רכה כדי להסיר תאי אפיתל תקועים בראש הבור וטבול אותו ב 70% EtOH ולאחר מכן PBS. הערה: לאחר הסרת תאי האפיתל עם הרקמה הרכה, ודא כי לא נתקעו פיסות רקמה בראש הבור.</li>
</ol>3. אקסוטומיה של עצבי הקרנית
<ol><li>בצע את שלב 1.4 כדי להכין את העכבר.</li>
	<li>הניחו את העכבר מתחת לזכוכית מגדלת דו-עינית בצד כדי לגשת לעין העוברת את הניתוח. שים את החלק התחתון של צלחת פטרי מתחת לראש העכבר כדי שהעין תהיה אופקית. הערה: השלבים הבאים יבוצעו על ידי התבוננות דרך זכוכית מגדלת דו-עינית.</li>
	<li>הסירו את הדמעה המלאכותית בעזרת צמר גפן והסירו את הריסים מבלי לגעת בעין.</li>
	<li>מניחים צבת חלקה ומעוקלת מתחת לעין החיה כדי להוציא אותה מהמסלול. הקפד לסגור את הצבת מספיק כדי שהעין לא תוכל לחזור למסלול ברגע שיופעל לחץ, אך לא יתר על המידה כדי למנוע נזק לעצב הראייה.</li>
	<li>החל את ניקוב הביופסיה של 2.5 מ"מ אנכית על העין ללא לחץ כדי להבטיח מגע מוחלט של האגרוף עם פני השטח של הקרנית. הערה: ברגע שהאגרוף מופעל על הקרנית, ידו של הנסיין עלולה להפריע לשדה הראייה.</li>
	<li>לאחר מכן, התחל להפעיל לחץ ולסובב את האגרוף מספר פעמים. הערה: בהתאם ללחץ, מספר הפיתולים עשוי להשתנות, אך בדרך כלל הוא סביב 5. זה דורש אימון כדי להרגיש את הלחץ והתנועה הנכונים. אם מופעל לחץ רב מדי, העין נקרעת. במקרה זה, ניתן לראות נוזלים יוצאים מהנגע והעין מתרככת. צריך להקריב את החיה.</li>
	<li>הסר את אגרוף הביופסיה. עיגול חייב להיות גלוי על הקרנית שבה הוחל אגרוף הביופסיה. הערה: השלבים הבאים אינם דורשים זכוכית מגדלת דו-עינית.</li>
	<li>בדוק אם לעין הנגדית עדיין יש ג'ל עיני ולמרוח קצת על העין האקסונמית.</li>
	<li>תן לעכבר להתעורר על כרית מחוממת (37 מעלות צלזיוס) והחזיר אותו לכלוב שלו כשהוא נע בכוחות עצמו.</li>
	<li>בדוק את רווחתו של בעל החיים במהלך היומיים הבאים.</li>
</ol>4. עיבוד הקרנית בהרכבה מלאה
<ol><li>איסוף דוגמאות וקיבוע.<ol><li>לשקול את העכבר ולגרום להרדמה על ידי ביצוע הזרקה intraperitoneal של 10 μL / g של משקל העכבר (MW) של פתרון ההרדמה.</li>
		<li>כאשר העכבר מפסיק לזוז ואין לו רפלקסים על ידי צביטת בוהן, בצע נקע צוואר הרחם.</li>
		<li>להוציא את העין מהמסלול באמצעות שתי אצבעות ולחנך את העין על ידי חיתוך עצב הראייה באמצעות מספריים מעוקלים.</li>
		<li>הניחו את העין בצינור פלסטיק בנפח 2 מ"ל המכיל PBS.</li>
		<li>תקן את העין על ידי החלפת PBS עם 4% paraformaldehyde והניח אותו על שייקר (30 סל"ד) בטמפרטורת החדר (RT) במשך 20 דקות.</li>
		<li>יש לשטוף 3 פעמים במשך 10 דקות עם PBS ב-RT על שייקר (30 סל"ד).</li>
	</ol></li>
	<li>דיסקציה של הקרנית<ol><li>מניחים טיפה של PBS על חתיכת פרפילם בתוך צלחת פטרי.</li>
		<li>הניחו את העין בטיפה זו של PBS.</li>
		<li>מניחים את צלחת הפטרי מתחת לזכוכית מגדלת דו-עינית.</li>
		<li>לנתח את הקרנית באמצעות מספריים microdissection ומלקחיים. חותכים מעל הגוף הרירי כדי לשמור על הלימבוס.</li>
		<li>הסר את העדשה, את הגוף הרירי, ואת הקשתית עם מלקחיים עדינים.</li>
		<li>מחזירים את הקרנית לצינור פלסטיק בנפח 2 מ"ל.</li>
	</ol></li>
	<li>פרוטוקול Immunofluorescence<ol><li>יש לדגור על הקרנית ב-2 מ"ל של 2.5% ג'לטין מעור דגים, 5% סרום עיזים ו-0.5% חומר ניקוי ב-PBS למשך שעה אחת ב-RT על שייקר (30 סל"ד).</li>
		<li>יש לדגור על הקרנית ב-150 מיקרוליטר של תמיסה של 2.5% ג'לטין מעור דגים, 5% סרום עיזים ו-0.1% חומר ניקוי ב-PBS המכיל את הנוגדן הראשוני המדולל ב-1/1000 (נוגדן אנטי βIII טובולין) למשך הלילה ב-4°C על שייקר (30 סל"ד).</li>
		<li>יש לשטוף 3 פעמים במשך שעה אחת עם חומר ניקוי 0.1% ב-PBS ב-RT על שייקר (30 סל"ד).</li>
		<li>לדגור על הקרנית באותה תמיסה כמו בשלב 4.3.2, המכיל את הנוגדן המשני מדולל ב 1/500 לילה ב 4 ° C על שייקר (30 סל"ד).</li>
		<li>יש לשטוף 3 פעמים במשך שעה עם PBS ב-RT על שייקר (30 סל"ד).</li>
		<li>לדגור על הקרנית במשך 10 דקות עם 150 μL של אינטרקלטור DNA מדולל ב 1/5000 ב RT על שייקר (30 סל"ד).</li>
		<li>יש לשטוף פעמיים במשך 5 דקות עם PBS.</li>
	</ol></li>
	<li>הרכבה של הקרנית<ol><li>הניחו את הקרנית על מגלשה, אפיתל פונה למגלשה, והשתמשו באזמל כדי ליצור ארבעה חלקים מבלי להגיע למרכז. הערה: בצע את המקטעים המנוגדים זה לזה כדי ליצור צורת פרח.</li>
		<li>הניחו את אנדותל הקרנית מול המגלשה והוציאו את PBS סביב הקרנית באמצעות רקמה. הערה: אין להסיר את PBS מתחת לקרנית; אחרת, בועות אוויר עשויות להופיע. אם כן, הוסיפו PBS לקרנית והסירו את בועת האוויר. לאחר מכן הפעל מחדש משלב 4.3.2.</li>
		<li>הוסיפו משחת דגם על ארבע פינות של מכסה מלבני. הערה: משחת הדגם מרימה את הכיסוי מכיוון שהקרנית היא רקמה עבה.</li>
		<li>יש לזרוק 50 μL של מדיום הרכבה על הקרנית ולהניח בזהירות את הכיסוי מעל כדי למנוע היווצרות בועות.</li>
		<li>יש לאטום את הכיסוי בלק.</li>
	</ol></li>
	<li>דימות<ol><li>הניחו את המגלשה מתחת למיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי.</li>
		<li>הגדר את גודל הפסיפס ואת עומק התמונה והתחל את הרכישה.</li>
		<li>החל תוכנית טשטוש ו deconvolution על התמונה שנרכשה. הערה: שלב 4.6.3 הוא אפשרות שנבחרה בתוכנת הרכישה (סליקה חישובית בנפח גדול [LVCC])</li>
	</ol></li>
</ol>5. אבלציה לייזר מקומית של עצבי הקרנית
<ol><li>הפעל את מיקרוסקופ המולטיפוטון הזקוף ואת הלייזר בשילוב מתנד פרמטרי אופטי. הפעל את השלב המחומם של המיקרוסקופ (37 ° C) והגדר את הלייזרים על 850 ננומטר ו 1100 ננומטר, המתאים לאורכי הגל הנדרשים עבור מודל העכבר.</li>
	<li>השתמש במד כוח כדי להגדיר את עוצמת הלייזרים בו זמנית בסביבות 20 mW.</li>
	<li>בצע את שלב 1.4 כדי להכין את העכבר ולהחיל ג'ל עיניים על שתי העיניים. הערה: בעל החיים המשמש לפרוטוקול זה חייב להיות מקו עכבר מהונדס (עכבר מהונדסMAGIC-Marker 21) המבטא פלואורופור אנדוגני בסיבי עצב הקרנית.</li>
	<li>התקן את בעל החיים במחזיק ראש. סובב את החיה ב -90 מעלות לעין המעניינת לפנות לתקרה.</li>
	<li>חגור את הוויבריסה של החיה כדי לנקות את אזור העיניים. חגור את גוף החיה כדי להפחית את תנועת הראש הנגרמת על ידי נשימה.</li>
	<li>הניחו כיסוי עגול על העין מעל ג'ל העין. תלוש הכיסוי צריך להיות אופקי. אל תהססו להזיז את ראש החיה כדי שהכיסוי ימוקם כראוי.</li>
	<li>הוסף טיפה של PBS מעל תלוש הכיסוי. הניחו את בעל החיים על במת המיקרוסקופ בזהירות וקבעו את צריח המטרה במרחק הנכון.</li>
	<li>השתמש במטרה מימית 20x ו epifluorescence כדי למקם את העין ואת העצבוב דרך העינית.</li>
	<li>הפעל את הלייזרים והגדר את העומק שיש להאיר.</li>
	<li>קבל תמונה של 1024 x 1024 (פיקסלים) במהירות רכישה של 70%-85% ממהירות הסריקה המרבית.</li>
	<li>לאחר רכישת התמונה, הסירו את בעל החיים מהמיקרוסקופ והסירו את הכיסוי ואת הרצועות. הסר את בעל החיים ממחזיק הראש, הוסף עוד ג'ל עיניים במידת הצורך, ותן לו להתעורר בכלוב על צלחת מחוממת. הערה: הרס של העצבוב ניתן לראות 1 שבוע לאחר ההדמיה. ניתן לחזור על פרוטוקול זה פעם בשבוע למשך מספר שבועות כדי להגדיל את הנזק שנגרם על ידי הלייזרים.</li>
	<li>כאשר החיה נעה בכוחות עצמה, להחזיר את הכלוב לאורווה ולבדוק את רווחתו במשך היומיים הבאים.</li>
</ol>

פרוטוקולי נזק לסיבי חישה בקרנית למחקרי רגנרציה של אקסונים

<ol>
	<li>Marfurt, C. F., Cox, J., Deek, S., Dvorscak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+corneal+innervation.">Anatomy of the human corneal innervation.</a> Exp Eye Res. 90 (4), 478-492 (2010).</li><li>Al-Aqaba, M. A., Dhillon, V. K., Mohammed, I., Said, D. G., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+nerves+in+health+and+disease.">Corneal nerves in health and disease.</a> Prog Retin Eye Res. 73, 100762 (2019).</li><li>Dua, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+keratopathy.">Neurotrophic keratopathy.</a> Prog Retin Eye Res. 66, 107-131 (2018).</li><li>Bonini, S., Rama, P., Olzi, D., Lambiase, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurotrophic+keratitis.">Neurotrophic keratitis.</a> Eye. 17 (8), 989-995 (2003).</li><li>Barrientez, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Injury:+Clinical+and+molecular+aspects.">Corneal Injury: Clinical and molecular aspects.</a> Exp Eye Res. 186, 107709 (2019).</li><li>Willmann, D., Fu, L., Melanson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+Injury.">Corneal Injury.</a> StatPearls. , (2023).</li><li>Kalha, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bmi1++progenitor+cell+dynamics+in+murine+cornea+during+homeostasis+and+wound+healing.">Bmi1+ progenitor cell dynamics in murine cornea during homeostasis and wound healing.</a> Stem Cells. 36 (4), 562-573 (2018).</li><li>Park, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potential+roles+of+nitrate+and+nitrite+in+nitric+oxide+metabolism+in+the+eye.">Potential roles of nitrate and nitrite in nitric oxide metabolism in the eye.</a> Sci Rep. 10 (1), 13166 (2020).</li><li>Ikkala, K., Stratoulias, V., Michon, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilateral+corneal+insult+in+Zebrafish+results+in+a+bilateral+cell+shape+and+identity+modification,+supporting+wound+closure.">Unilateral corneal insult in Zebrafish results in a bilateral cell shape and identity modification, supporting wound closure.</a> bioRxiv. , (2021).</li><li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substance+P+promotes+diabetic+corneal+epithelial+wound+healing+through+molecular+mechanisms+mediated+via+the+Neurokinin-1+receptor.">Substance P promotes diabetic corneal epithelial wound healing through molecular mechanisms mediated via the Neurokinin-1 receptor.</a> Diabetes. 63 (12), 4262-4274 (2014).</li><li>Zhao, W., He, X., Liu, R., Ruan, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accelerating+corneal+wound+healing+using+exosome-mediated+targeting+of+NF-&#954;B+c-Rel.">Accelerating corneal wound healing using exosome-mediated targeting of NF-&#954;B c-Rel.</a> Inflamm Regen. 43 (1), 6 (2023).</li><li>Downie, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+the+sub-basal+nerve+plexus+and+superficial+nerve+terminals+after+corneal+epithelial+injury+in+mice.">Recovery of the sub-basal nerve plexus and superficial nerve terminals after corneal epithelial injury in mice.</a> Exp Eye Res. 171, 92-100 (2018).</li><li>He, J., Pham, T. L., Kakazu, A. H., Bazan, H. E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+of+substance+P+sensory+nerves+and+transient+receptor+potential+melastatin+8+(TRPM8)+cold+receptors+after+corneal+experimental+surgery.">Remodeling of substance P sensory nerves and transient receptor potential melastatin 8 (TRPM8) cold receptors after corneal experimental surgery.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 60 (7), 2449-2460 (2019).</li><li>Bandeira, F., Yusoff, N. Z., Yam, G. H. -. F., Mehta, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+reinnervation+following+refractive+surgery+treatments.">Corneal reinnervation following refractive surgery treatments.</a> Neural Regen Res. 14 (4), 557-565 (2019).</li><li>Erie, J. C., McLaren, J. W., Hodge, D. O., Bourne, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recovery+of+corneal+subbasal+nerve+density+after+PRK+and+LASIK.">Recovery of corneal subbasal nerve density after PRK and LASIK.</a> Am J Ophthalmol. 140 (6), 1059-1064.e1 (2005).</li><li>Coleman, M. P., Freeman, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wallerian+degeneration,+WldS,+and+Nmnat.">Wallerian degeneration, WldS, and Nmnat.</a> Annu Rev Neurosci. 33, 245-267 (2010).</li><li>Arenas, E., Esquenazi, S., Anwar, M., Terry, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellar+corneal+transplantation.">Lamellar corneal transplantation.</a> Surv Ophthalmol. 57 (6), 510-529 (2012).</li><li>Niederer, R. L., Perumal, D., Sherwin, T., McGhee, C. N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Corneal+innervation+and+cellular+changes+after+corneal+transplantation:+An+in+vivo+confocal+microscopy+study.">Corneal innervation and cellular changes after corneal transplantation: An in vivo confocal microscopy study.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 48 (2), 621-626 (2007).</li><li>Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phototoxicity+in+live+fluorescence+microscopy,+and+how+to+avoid+it.">Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it.</a> BioEssays. 39 (8), 1700003 (2017).</li><li>Volatier, T., Schumacher, B., Cursiefen, C., Notara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=UV+protection+in+the+cornea:+Failure+and+rescue.">UV protection in the cornea: Failure and rescue.</a> Biology. 11 (2), 278 (2022).</li><li>Loulier, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplex+cell+and+lineage+tracking+with+combinatorial+labels.">Multiplex cell and lineage tracking with combinatorial labels.</a> Neuron. 81 (3), 505-520 (2014).</li><li>Dana, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expert+consensus+on+the+identification,+diagnosis,+and+treatment+of+neurotrophic+keratopathy.">Expert consensus on the identification, diagnosis, and treatment of neurotrophic keratopathy.</a> BMC Ophthalmol. 21 (1), 327 (2021).</li><li>Matsumoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autologous+serum+application+in+the+treatment+of+neurotrophic+keratopathy.">Autologous serum application in the treatment of neurotrophic keratopathy.</a> Ophthalmology. 111 (6), 1115-1120 (2004).</li><li>Bonini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phase+II+randomized,+double-masked,+vehicle-controlled+trial+of+recombinant+human+nerve+growth+factor+for+neurotrophic+keratitis.">Phase II randomized, double-masked, vehicle-controlled trial of recombinant human nerve growth factor for neurotrophic keratitis.</a> Ophthalmology. 125 (9), 1332-1343 (2018).</li><li>Aggarwal, S., Colon, C., Kheirkhah, A., Hamrah, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficacy+of+autologous+serum+tears+for+treatment+of+neuropathic+corneal+pain.">Efficacy of autologous serum tears for treatment of neuropathic corneal pain.</a> Ocul Surf. 17 (3), 532-539 (2019).</li><li>Singh, N. P., Said, D. G., Dua, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lamellar+keratoplasty+techniques.">Lamellar keratoplasty techniques.</a> Indian J Ophthalmol. 66 (9), 1239-1250 (2018).</li><li>Gautier, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AAV2/9-mediated+gene+transfer+into+murine+lacrimal+gland+leads+to+a+long-term+targeted+tear+film+modification.">AAV2/9-mediated gene transfer into murine lacrimal gland leads to a long-term targeted tear film modification.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 1-16 (2022).</li></ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

קרטיטיס נוירוטרופית נחשבת למחלה נדירה, המשפיעה על 5 מתוך 10,000 אנשים. עם זאת, אנשים הסובלים NK עקב פגיעה פיזית כגון כוויות כימיות, או תסמונות כגון סוכרת או טרשת נפוצה אינם נכללים בסטטיסטיקה זו3. יתר על כן, מצב זה עדיין מאובחן באופן משמעותי22, ושכיחות המחלה מוערכת בחסר. י...

הקרנית, שהיא פני השטח השקופים של העין, מורכבת משלוש שכבות נפרדות: האפיתל, הסטרומה והאנדותל. לאיבר זה יש את צפיפות העצבוב הגבוהה ביותר בגוף והוא מורכב בעיקר מסיבי חישה (סוגים Aδ ו- C) שמקורם בענף העיניים של הגנגליון הטריגמינלי. סיבי החישה חודרים לשולי הקרנית באמצע הסטרומה בצורה של צרורות גדולים המסתעפים החוצה כדי לכסות את פני השטח. לאחר מכן הם מתפצלים כדי לחדור את קרום באומן וליצור את המקלעת התת-בסיסית, אשר ניתנת לזיהוי בקלות על ידי היווצרות מערבולת במרכז הקרנית. סיבים אלה מסתיימים כקצות עצבים חופשיים על פני השטח החיצוניים של האפיתל. הם מסוגלים להמיר גירויים תרמיים, מכניים וכימיים ולשחרר גורמים טרופיים החיוניים להומאוסטזיסאפיתל 1,2. Neurotrophic keratitis (NK) היא מחלה ניוונית המשפיעה על עצבוב חושי הקרנית. מחלה נדירה זו נובעת מירידה או אובדן רגישות בקרנית הגורמת לייצור דמעות נמוך יותר ולתכונות ריפוי לקויות של הקרנית3. NK מתקדם דרך שלושה שלבים המתוארים היטב, משלב 1 שבו חולים סובלים ממומים אפיתליאליים, לשלב 3 שבו סטרומה נמסה ו / או ניקוב הקרנית להתרחש4.
מבחינה קלינית, מקורותיה של מחלה זו יכולים להיות מגוונים. חולים יכולים לאבד עצבוב הקרנית לאחר פגיעה פיזית בעין, ניתוח, או באמצעות מחלות כרוניות, כגון סוכרת 5,6. עד כה, תהליך הפתוגנזה של NK נותר מובן היטב, והאפשרויות הטיפוליות למצב מסכן ראייה זה מוגבלות מאוד. לכן, יש צורך בהבנה טובה יותר של המאפיינים של פגמים אפיתליאליים כדי להבין טוב יותר את המנגנונים העומדים מאחורי התחדשות סיבים אלה ולקדם אותם. כאן, אנו מציעים מספר מודלים של פגיעה בקרנית הגורמת NK בעכברים.
המודל הראשון הוא שחיקה של שכבת האפיתל של הקרנית עם בור העין. מודל זה נחקר בעיקר בהקשר של התחדשות האפיתל בבעלי חיים שונים, כגון מכרסמים ודגים 7,8,9, וכדי לבדוק מולקולות המקדמות ריפוי קרנית10,11. מבחינה פיזיולוגית, לוקח 2-3 ימים לתאי האפיתל לסגור את הפצע. הדפוס הפיזיולוגי של העצבוב, לעומת זאת, לוקח יותר מארבעה שבועות להתאושש מהשחיקה12,13. במהלך הניתוח, בור העין מסיר את שכבת האפיתל של הקרנית המכילה את המקלעת התת-בזאלית ואת קצות העצבים החופשיים של הסיבים. הליך זה ניתן להשוות קלינית לחולים עם keratectomy photorefractive (PRK) כדי לתקן פגמים שבירה בעין. ההליך מורכב מהסרת האפיתל של הקרנית ולאחר מכן עיצוב מחדש של הסטרומה עם לייזר14. חולים יכולים לחוות מספר תופעות לוואי לאחר ניתוח כזה, כגון ירידה בצפיפות עצב הקרנית למשך שנתיים וירידה ברגישות למשך 3 חודשים עד שנה לאחר הניתוח15. בהתחשב בכך שהניתוח גורם לשבריריות של מיקרו-סביבה בקרנית, מודל זה יכול לסייע לחקור תופעות לוואי אלה ולפתח גישות טיפוליות שיקדמו עצבוב מחדש מהיר יותר, ובכך להפחית את תופעות הלוואי המדוברות.
המודל השני מורכב מחיתוך האקסונים בשולי הקרנית באמצעות ניקוב ביופסיה, הגורם לניוון וולרי של העצבוב המרכזי 16. מבחינה קלינית, ניתן להשוות שיטה זו לקרטופלסטיקה למלרית קדמית, שבה המנתח מבין טרפינציה חלקית של הקרנית כדי להסיר חלק מהעובי הקדמי של הקרנית ולהחליפו בהשתלת תורם 17. לאחר קרטופלסטיקה למלרית, חולים עלולים לסבול ממספר תסמינים, כולל עין יבשה, אובדן עצבוב הקרנית ודחיית השתל18. מודל אקסוטומיה זה המבוצע על עצבי הקרנית יכול לספק תובנה לגבי מנגנוני ניוון הסיבים, המתרחש לאחר השתלה, ואחריה התחדשות האקסונים.
השיטה השלישית פוגעת בעצבי הקרנית באמצעות לייזר. על ידי שימוש במיקרוסקופ מולטיפוטון על הקרנית של בעלי חיים מורדמים, ניוון העצבים הממוקמים בשדה האופטי מושרה כתוצאה מהיווצרות מיני חמצן תגובתי (ROS), מה שמוביל לנזק לדנ"א ולקוויטציה תאית19. שיטה זו משחזרת את נזקי האור של הקרנית הנגרמים על ידי חשיפת יתר לקרינת UV טבעית (כוויות שמש), אשר גם מפעילה היווצרות ROS, מה שמוביל לנזק לדנ"א20. חולים הסובלים מכוויות שמש בקרנית חווים כאב רב, שכן הידרדרות תאי האפיתל שוללת את הגפיים של סיבי הקרנית מכל.
שלוש השיטות המתוארות כאן נועדו לאפשר חקירה של תהליך הפתוגנזה NK והתחדשות אקסונים. הם ניתנים לשחזור ומדויקים בקלות. יתר על כן, הם מאפשרים התאוששות מהירה וניטור קל של בעלי החיים.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.2 &#181;m seringe filter</td>
			<td>CLEARLINE</td>
			<td>51733</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.5 mm rust ring remover</td>
			<td>Alger Equipment Company</td>
			<td>BU-5S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 mL plastic tubes</td>
			<td>Eppendrof&#160;</td>
			<td>30120094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Algerbrush burr, Complete instrument</td>
			<td>Alger Equipment Company</td>
			<td>BR2-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-beta III Tubulin antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab18207</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antigenfix</td>
			<td>Diapath</td>
			<td>P0016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artificial tear</td>
			<td>Larmes artificielles Martinet</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Buprecare</td>
			<td>Animalcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Any provider</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting tools</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein</td>
			<td>Merck</td>
			<td>103887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gelatin from cold water fish skin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G7765</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Merck</td>
			<td>S26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Head Holder</td>
			<td>Narishige</td>
			<td>SGM 4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated plate</td>
			<td>BIOSEB LAB instruments</td>
			<td>BIO-HE002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>H3570</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imalgene 1000</td>
			<td>BOEHRINGER INGELHEIM ANIMAL HEALTH France</td>
			<td>N/A</td>
			<td>French marketing authorization numbre: FR/V/0167433 4/1992</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LAS X software</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Large volume computational clearing (LVCC) process</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser Chameleon Ultra II</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laser power meter</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leica Thunder Imager Tissue microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multi-photon Zeiss LSM 7MP upright microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ocry-gel</td>
			<td>TVM lab</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parametric oscillator</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penlights with blue cobalt filtercap</td>
			<td>Bernell</td>
			<td>ALPEN</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150318</td>
			<td>Axotomy protocol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petridish</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>150288</td>
			<td>Cornea whole-mount processing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rompun 2%</td>
			<td>Elanco</td>
			<td>N/A</td>
			<td>French marketing authorization numbre: FR/V/8146715 2/1980</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile biopsy punch 2.5 mm</td>
			<td>LCH medical</td>
			<td>LCH-PUK-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton X-100</td>
			<td>VWR</td>
			<td>0694</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield</td>
			<td>EuroBioSciences</td>
			<td>H-1000</td>
			<td>Mounting medium</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three strategies to induce neurotrophic keratitis and nerve regeneration in murine cornea

הקרנית היא רקמה שקופה המכסה את העין והיא חיונית לראייה ברורה. זוהי הרקמה העצבנית ביותר בגוף. עצבוב זה מספק תחושה ותפקוד טרופי לעין ותורם לשמירה על שלמות הקרנית. השיבוש הפתולוגי של עצבוב זה נקרא קרטיטיס נוירוטרופית. זה יכול להיות מופעלות על ידי פגיעה בעין, ניתוח, או מחלה. במחקר זה, אנו מציעים שלושה פרוטוקולים שונים לגרימת נזק לעצבוב בדרכים המשחזרות את שלושת סוגי המקרים בהם נתקלים בדרך כלל במרפאה.
השיטה הראשונה מורכבת בביצוע שחיקה של אפיתל עם בור אופתלמי. מדובר בהסרת שכבת האפיתל, קצות העצבים החופשיים והמקלעת התת-בזאלית באופן דומה לניתוח כריתת קרניים פוטו-רפרקטיבי המבוצע במרפאה. השיטה השנייה מכוונת לעצבוב רק על ידי חתיכתו בפריפריה עם ניקוב ביופסיה, תוך שמירה על שלמות האפיתל. שיטה זו דומה לשלבים הראשונים של קרטופלסטיקה למלרית ומובילה לניוון של העצבוב ואחריו צמיחה מחודשת של האקסונים בקרנית המרכזית. השיטה האחרונה פוגעת בעצבוב של מודל עכבר מהונדס באמצעות מיקרוסקופ מולטיפוטון, אשר ממקם באופן ספציפי את אתר הצריבה של סיבי העצב הפלואורסצנטיים. שיטה זו גורמת לאותו נזק כמו פוטוקרטיטיס, חשיפת יתר לאור UV.
מחקר זה מתאר אפשרויות שונות לחקר הפיזיופתולוגיה של עצבוב הקרנית, במיוחד הניוון וההתחדשות של האקסונים. קידום התחדשות הוא חיוני למניעת סיבוכים כגון פגמים אפיתל או אפילו ניקוב של הקרנית. המודלים המוצעים יכולים לסייע בבדיקת מולקולות פרמקולוגיות חדשות או ריפוי גנטי המשפרים את התחדשות העצבים ומגבילים את התקדמות המחלה.

The cornea, which is the transparent surface of the eye, is composed of three distinct layers: the epithelium, the stroma, and the endothelium. This organ has the highest density of innervation in the body and is composed mainly of sensory fibers (types A&#948; and C) originating from the ophthalmic branch of the trigeminal ganglion. Sensory fibers penetrate the periphery of the cornea in the mid-stroma in the form of big bundles that branch out to cover the surface. They then bifurcate to pierce the Bowmann&#39;s membrane and form the subbasal plexus, which is easily recognizable by the formation of a vortex in the center of the cornea. Those fibers terminate as free nerve endings at the external surface of the epithelium. They are able to transduce thermal, mechanical, and chemical stimuli and to release trophic factors that are essential for epithelium homeostasis1,2. Neurotrophic keratitis (NK) is a degenerative disease affecting the corneal sensory innervation. This rare disease stems from a decrease or a loss of corneal sensitivity that results in lower tear production and poor healing properties of the cornea3. NK progresses through three well-described stages, from stage 1 where patients suffer epithelial defects, to stage 3 where stromal melting and/or corneal perforation occur4.
Clinically, the origins of this disease can be diverse. Patients can lose corneal innervation after physical injury to the eye, surgery, or through chronic diseases, such as diabetes5,6. To date, the NK pathogenesis process remains poorly understood, and therapeutical options for this sight-threatening condition are very limited. Therefore, a better understanding of the characteristics of epithelial defects is needed to better understand the mechanisms behind the regeneration of those fibers and potentially promote them. Here, we propose several models of corneal injury that induce NK in mice.
The first model is the abrasion of the epithelial layer of the cornea with an ocular burr. This model has mainly been studied in the context of the regeneration of the epithelium in different animals, such as rodents and fish7,8,9, and to test molecules promoting corneal healing10,11. Physiologically, it takes 2-3 days for the epithelial cells to close the wound. The physiological pattern of the innervation, however, takes more than four weeks to recover from the abrasion12,13. During the surgery, the ocular burr removes the epithelial layer of the cornea that contains the subbasal plexus and the fibers&#39; free nerve endings. This procedure can be clinically compared to patients with photorefractive keratectomy (PRK) to correct eye refractive defects. The procedure consists of removing the epithelium of the cornea and then reshaping the stroma with a laser14. Patients can experience several side effects following such surgery, such as a decrease of corneal nerve density for 2 years and a reduction in sensitivity for a duration of 3 months to one year post-surgery15. Given that the surgery induces a fragility of the corneal microenvironment, this model could help investigate these side effects and develop therapeutical approaches that would promote faster reinnervation, thus reducing the side effects in question.
The second model consists of sectioning the axons at the periphery of the cornea with a biopsy punch, inducing a Wallerian degeneration of the central innervation 16. Clinically, this method could be compared to anterior lamellar keratoplasty, in which the surgeon realizes a partial trephination of the cornea to remove a part of the anterior thickness of the cornea and replace it with a donor transplant 17. Following lamellar keratoplasty, patients may suffer from a number of symptoms including dry eye, loss of corneal innervation and graft rejection18. This axotomy model performed on corneal nerves could provide insight into the mechanisms of fiber degeneration, which occurs after a graft, followed by the axons&#39; regeneration.
The third method damages the corneal nerves with a laser. By using a multiphoton microscope on the cornea of anesthetized animals, degeneration of the nerves localized in the optical field is induced as a result of reactive oxygen species (ROS) formation, which leads to DNA damage and cellular cavitation19. This method recapitulates the corneal photodamage induced by overexposure to natural UV (sunburn), which also triggers ROS formation, leading to DNA damage20. Patients who suffer from corneal sunburn experience great pain, as the deterioration of epithelial cells deprives the corneal fibers&#39; extremities of all.
The three methods described here are designed to enable the investigation of the NK pathogenesis process and axon regeneration. They are easily reproducible and precise. Moreover, they allow quick recovery and easy monitoring of the animals.

מחבר זרקור: קידום מחקר אינרבציה של הקרנית באמצעות מודלים חדשניים 

שלוש אסטרטגיות לגרימת קראטיטיס נוירוטרופית והתחדשות עצבית בקרנית מורין

The cornea, which is the transparent tissue covering the eye, requires a balanced microenvironment to maintain its integrity. The dense innervation of the cornea participates to this microenvironment. If there is a loss, which could be partial or total, of this innervation, then a specific condition arises, which is called neurotrophic keratitis.To find new cures and efficient cures for this disease, we need to have specific models. The expansion of the use of transgenic animal bearing fluorescent reporters and microscopic advances have opened new possibilities in visualizing axonary generation. In vivo imagine has become more accessible to any research lab willing to follow the neurogeneration process.The various causes inducing neurotrophic keratitis underlying the difficulties of having only one model to test nerve regeneration therapies. These three models are reproducing various situations seen in clinics, and sharing those methods will allow other labs to uncover new aspects of corneal innervation from which innovative treatments will be designed.

מחקר זה מציע מספר פרוטוקולים לגרימת נזק לעצבוב הקרנית בעכברים. בעוד פרוטוקולים דומים שימשו לחקר הפיזיופתולוגיה של ריפוי האפיתל, בחרנו להתאים ולפתח שיטות חדשות לחקר התחדשות עצבוב הקרנית. כדי להתבונן בעצבוב, השתמשנו בשתי טכניקות. ראשית, השתמשנו בטכניקת אימונופלואורסנציה כדי להכתים את סיב?...

Watch this Scientific Journal Video about Advancing Corneal Innervation Research Through Innovative Models at JoVE.com

כאן, אנו מציעים שלוש שיטות שונות לפגיעה בסיבי החישה המעצבבים את הקרנית. שיטות אלה מקלות על חקר התחדשות האקסון בעכברים. שלוש שיטות אלה, הניתנות להתאמה למודלים אחרים של בעלי חיים, אידיאליות לחקר הפיזיולוגיה וההתחדשות של עצבוב הקרנית.

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation ...

הקרנית, שהיא הרקמה השקופה המכסה את העין, זקוקה למיקרו-סביבה מאוזנת כדי לשמור על שלמותה. העצבוב הצפוף של הקרנית משתתף במיקרו-סביבה זו. אם יש אובדן, אשר יכול להיות חלקי או מוחלט, של עצבוב זה, אז מצב מסוים עולה, אשר נקרא קרטיטיס neurotrophic.כדי למצוא תרופות חדשות ותרופות יעילות למחלה זו, אנו זקוקים למודלים ספציפיים. הרחבת השימוש בכתבים פלואורסצנטיים בעלי חיים טרנסגניים והתקדמות מיקרוסקופית פתחו אפשרויות חדשות בהדמיה של יצירה אקסונרית. In vivo imagine הפכה לנגישה יותר לכל מעבדת מחקר שמוכנה לעקוב אחר תהליך הנוירוגנרציה.הגורמים השונים הגורמים לקרטיטיס נוירוטרופית עומדים בבסיס הקשיים של מודל אחד בלבד לבדיקת טיפולי התחדשות עצבית. שלושת המודלים הללו משחזרים מצבים שונים שנצפו במרפאות, ושיתוף שיטות אלה יאפשר למעבדות אחרות לחשוף היבטים חדשים של עצבוב הקרנית שמהם יתוכננו טיפולים חדשניים.

three-strategies-to-induce-neurotrophic-keratitis-nerve-regeneration

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Three Strategies to Induce Neurotrophic Keratitis and Nerve Regeneration in Murine Cornea

1.0K Views.  University of  Montpellier, INSERM. הקרנית, שהיא הרקמה השקופה המכסה את העין, זקוקה למיקרו-סביבה מאוזנת כדי לשמור על שלמותה. העצבוב הצפוף של הקרנית משתתף במיקרו-סביבה זו. אם יש אובדן, אשר יכול להיות חלקי או מוחלט, של עצבוב זה, אז מצב מסוים עולה, אשר נקרא קרטיטיס neurotrophic.כדי למצוא תרופות חדשות ותרופות יעילות למ?...

Video: מחבר זרקור: קידום מחקר אינרבציה של הקרנית באמצעות מודלים חדשניים 

The cornea is a transparent tissue that covers the eye and is crucial for clear vision. It is the most innervated tissue in the body. This innervation provides sensation and trophic function to the eye and contributes to preserving corneal integrity. The pathological disruption of this innervation is termed neurotrophic keratitis. This can be triggered by injury to the eye, surgery, or disease. In this study, we propose three different protocols for inflicting damage on the innervation in ways that recapitulate the three types of cases generally encountered in the clinic.
The first method consists in making an abrasion of the epithelium with an ophthalmic burr. This involves the removal of the epithelial layer, the free nerve endings, and the subbasal plexus in a manner similar to the photorefractive keratectomy surgery performed in the clinic. The second method&#160;only targets the innervation by sectioning it at the periphery with a biopsy punch, maintaining the integrity of the epithelium. This method is similar to the first steps of lamellar keratoplasty and leads to a degeneration of the innervation followed by regrowth of the axons in the central cornea. The last method damages the innervation of a transgenic mouse model using a multiphoton microscope, which specifically localizes the site of cauterization of the fluorescent nerve fibers. This method inflicts the same damage as photokeratitis, an overexposure to UV light.
This study describes different options for investigating the physiopathology of corneal innervation, particularly the degeneration and regeneration of the axons. Promoting regeneration is crucial for avoiding such complications as epithelium defects or even perforation of the cornea. The proposed models can help test new pharmacological molecules or gene therapy that enhance nerve regeneration and limit disease progression.

Here, we propose three different methods of damaging the sensory fibres innervating the cornea. These methods facilitate the study of axon regeneration in mice. These three methods, which are adaptable to other animal models, are ideal for the study of corneal innervation physiology and regeneration.

Murine Corneal Nerve Abrasion for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal abrasion, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Next, position the mouse on its side on a heated plate. Gently use a cotton swab to absorb the artificial tear, and brush aside the mouse's eyelashes without making contact with the eye. Turn on the ocular burr, and carefully open the mouse's eyelid with two fingers.Simultaneously shield the vibrancy to prevent them from entangling in the burr. Locate the pupil or the eye center and gently apply the ocular burr to the eye's surface in circular motions until the epithelium is removed. Alternatively, perform about 20 circular movements on the cornea.Now apply a drop of fluorescent staining solution on the abraided eye. After 20 seconds, dab the eye with a tissue to absorb the solution. Then rinse it with a drop of artificial tear.Finally, absorb the artificial tear with a tissue, and illuminate the eye using a blue cobalt lamp. Prior to the surgery, the basal epithelium was intact and the nerve fibers in the sub basal plexus formed a vortex. The burr tip removed the outer corneal layer, leaving the stroma and endothelium intact with a visible gap at the basal epithelium and sub basal plexus.Regeneration of the epithelium occurred over a week post-surgery. However, the vortex remained absent from the corneal center.

שחיקת עצב הקרנית להשראת קראטיטיס נוירוטרופית

Murine Corneal Nerve Axotomy for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin corneal nerve axotomy, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of artificial tear on the eye undergoing the surgery. Apply a drop of ocular gel on the contralateral eye.Position the mouse under a binocular loupe to assess the eye that is being operated on. Place the bottom of a Petri dish under the mouse's head to keep the eye horizontal. With a cotton swab, carefully dad the artificial tear from the eye and remove the eyelashes without touching the eye.Place a pair of smooth curved pillars under the animal's eye and gently pop it out of the orbit. Gently place a biopsy punch vertically against the cornea surface, apply pressure, and twist the punch several times. Then, remove the biopsy punch and a circular mark should be visible on the cornea.A thin peripheral ring was seen at the point where the biopsy punch was applied, which damaged the basal epithelium. The peripheral nerves appeared to be sectioned, triggering the Wallerian axon degeneration. Heavy degeneration was observed, leading to total loss of innervation in the cornea center.This resulted in the disintegration of the epithelial layer, creating an ulcer.

אקסוטומיה עצבית הקרנית של מורין להשראת קראטיטיס נוירוטרופית

Localized Laser Ablation of Murine Corneal Nerves for the Induction of Neurotrophic Keratitis

To begin, place an anesthetized mouse on a table. Apply a drop of ocular gel on both eyes. Place the animal in a head holder to secure its position.Rotate the animal by 90 degrees so that the eye being operated on faces the ceiling. Secure the animal's vibrancy to clear the area around the eye. Secure the animal's body to minimize head movements caused by breathing.Place a circular cover slip horizontally over the eye on top of the ocular gel. Adjust the animal's head as necessary to correctly position the cover slip. Add a drop of PBS on top of the cover slip, then carefully place the animal onto a microscope stage.Adjust the objective turret of the microscope to the appropriate distance for observation. Activate the lasers to induce corneal nerve ablation. Once nerve ablation is complete, remove the animal from the head holder and place it in a cage on a heated plate.The vortex was visibly absent one week after laser ablation. A group of immune cells were observed to have migrated to the illumination site. The stromal fiber bundles appeared to have thinned out.