نشكر بصدق الدعم المقدم من مشروع المواهب بجامعة تشونغتشينغ الطبية (رقم R4014 إلى DSP و R4020 إلى PPJ) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC ، رقم 32200386 إلى PPJ) ، واستوديو تشونغتشينغ للابتكار بعد الدكتوراه (X7928 DSP) ، وبرنامج المركز الصيني السريلانكي المشترك لأبحاث تكنولوجيا المياه ومظاهرة من قبل الأكاديمية الصينية للعلوم (CAS) / المركز المشترك بين الصين وسريلانكا للتعليم والبحث من قبل CAS.

تحسين نماذج أسماك الزرد GF: التوليد والصيانة والدراسات الميكروبية

تم منح بروتوكول GF Artemia كبراءة اختراع من قبل الإدارة الوطنية الصينية للملكية الفكرية ، والتي ستخفف من الاستخدام المقيد للطريقة بعد الحصول على إذن المؤلفين. يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح منافسة أو مالية أخرى.

الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكولات أسماك GF وإعداد الطعام GF خلال توليد نماذج أسماك GF ، تم تضمين العديد من الخطوات الحاسمة ، بما في ذلك تحضير المواد المعقمة ، وتعقيم الأجنة ، والتجديد اليومي ل GZM ، وجمع العينات المختلفة ، والفحص المعقم لكل عينة باستخدام طرق متعددة. من بين هذه الخطوات ،...

تلعب الجراثيم (أي العتائق والبكتيريا وحقيقيات النوى والفيروسات) أدوارا حاسمة في الحفاظ على صحة المضيف والمساهمة في تطور الأمراض المختلفة من خلال التأثير على العمليات الفسيولوجية والمرضية من خلال التفاعلات التكافلية داخل الحاجز المعوي والسطح الظهاري ووظائف الميوسين لدى الأفراد1،2،3. يتشكل تكوين الجراثيم عبر مراحل الحياة المختلفة ، من الطفولة إلى الأحداث ، والبلوغ ، والشيخوخة ، بالإضافة إلى وجودها في مواقع مختلفة مثل مواقع الفم والفم والجلد والأمعاء ، بشكل ديناميكي من خلال الموائل والبيئات المتنوعة4. تشارك الجراثيم المعوية في الكائنات الحية في امتصاص العناصر الغذائية ، والاستجابة المناعية ، وغزو مسببات الأمراض ، وتنظيم التمثيل الغذائي ، وما إلى ذلك 5,6. أظهرت الدراسات التي أجريت على المرضى أن الاضطرابات في ميكروبات الأمعاء مرتبطة بالسمنة البشرية واضطرابات النوم والاكتئاب ومرض التهاب الأمعاء (IBD) والأمراض التنكسية العصبية (باركنسون والزهايمر) والشيخوخة وأنواع السرطانالمختلفة 7،8،9. علاوة على ذلك ، تتضمن المسارات التفاعلية بين ميكروبيوتا الأمعاء والمضيفين عوامل التهابية ، وناقلات عصبية ، ومستقلبات ، وحاجز معوي ، وإجهاد تأكسدي ، كما لوحظ في الأبحاث السابقة باستخدام نماذج الفئران والأسماك10،11.
في الآونة الأخيرة ، تم استكشاف العديد من الأساليب أو العلاجات المتعلقة بالبكتيريا ، بما في ذلك البروبيوتيك المحتمل وزرع الجراثيم البرازية (FMT) ، لهذه الاضطرابات في النماذج السريرية والحيوانية. تستند هذه الاستكشافات إلى الاكتشافات المتعلقة بمحور الجراثيم والأمعاء والدماغ / الكبد / الكلى ، والمنتجات المشتقة من الميكروبات ، ونشاط المستقبلات المتغير12،13. ومع ذلك ، فإن تطوير ووظائف وآليات مختلفة لنظام مضيف الميكروبات لا يزال غير مفهوم ومحدد بشكل كامل بسبب تعقيد المجتمع الميكروبي والتحدي المتمثل في توليد نماذج أمراض قوية تشبه الإنسان.
لمعالجة هذه القضايا ، تم اقتراح نماذج حيوانية خالية من الجراثيم (GF) على وجه السرعة فيمنتصف القرن 19 وتم تطويرها بشكل أساسيخلال القرن 20. التحسينات اللاحقة ، بما في ذلك النماذج المعالجة بالمضادات الحيوية و gnotobiotic ، جنبا إلى جنب مع التطورات في تقنيات الكشف عن الميكروبات ومراقبتها ، زادت من إتقان هذه النماذج14،15،16. تقدم GF ، التي تم إنشاؤها عن طريق محو خلفيتها الخاصة وتجنب الميكروبات البيئية ، استراتيجية ممتازة لاستكشاف التفاعلات بين الكائنات الحية الدقيقة ومضيفيها17. من خلال تطبيق النماذج الحيوانية والبروتوكولات المكررة ، نجح الباحثون في تكرار التركيبات الميكروبية المماثلة الموجودة في المرضى في الفئران والأسماك GF. بالإضافة إلى ذلك ، توفر النماذج الحيوانية الأخرى GF ، مثل والدجاج والخنازير ، خيارات متنوعة كمواضيع بحثية18،19،20،21. وقد مكن هذا النهج من إجراء تحقيقات في الآثار العلاجية المحتملة للميكروبات المتعايشة على أمراض مختلفة ، بما في ذلك العلاج المناعي للسرطان لدى البشر16،18. تقدم نماذج GF رؤى أكثر دقة حول خصائص وآليات الاستعمار البكتيري المحدد والهجرة والتكاثر والتفاعل داخل المضيفين. يوفر هذا رؤى جديدة حاسمة حول حدوث وتطور الأمراض المرتبطة بالميكروبات22,23. تطور تاريخ إنشاء وتطبيق أسماك الزرد GF في الأبحاث الميكروبية من تقارير Rawls et al. في عام 2004 و Bates et al. في عام 2006 إلى بروتوكول Melancon et al. في عام 201716،24،25. ومع ذلك ، لا تزال جدوى نماذج GF البالغة أو المتكاثرة عملية طويلة ، مصحوبة بطول العمر المتغير ومعدلات النجاح والتحديات الصحية.
من بين النماذج الحيوانية المختلفة ، تبرز أسماك الزرد (Danio rerio) كأداة حاسمة لكل من البحوث الأساسية والطبية الحيوية نظرا لتشابهها المفيد مع الأعضاء البشرية وعلم الجينوم ، ودورة النمو القصيرة ، والخصوبة العالية ، والأجنة الشفافة19,26. يقدم الزرد ، الذي يعمل كنماذج موثوقة للأمراض البشرية ، تمثيلا مرئيا للعمليات الفسيولوجية والمرضية في الجسم الحي ، مما يوفر نظرة ثاقبة للسمات الجذابة للتفاعلات بين المضيف والميكروب. والجدير بالذكر أن أسماك الزرد تظهر سلالات خلايا متميزة ، مما يسمح بتصوير فسيولوجيا الأمعاء ، والديناميات الميكروبية ، والغدد التناسلية والتطور التناسلي ، ونضج الجهاز المناعي المضيف ، والسلوك ، والتمثيل الغذائي27. تتطور أجنة الزرد داخل الحبال الواقية حتى الفقس ، وتصبح يرقات في 3 أيام بعد الإخصاب (dpf). يبحثون بنشاط عن الطعام عند 5 dpf ويصلون إلى مرحلة النضج الجنسي بعد حوالي 3 أشهر من الإخصاب (mpf) 28. أظهر أول سمكة زرد ناجحة خالية من الجراثيم (GF) ، أبلغ عنها Rawls et al.24 ، أن اليرقات التي تتغذى على الأعلاف المعقمة بعد امتصاص صفار البيض أظهرت نخرا في الأنسجة من 8 dpf والموت الكلي عند 20 dpf. وقد أشار ذلك إلى آثار النظام الغذائي أو أهمية النظر في إمدادات المغذيات الخارجية في التجارب التي تنطوي على أسماك GF طويلة الأجل (>7 dpf)29. حسنت الدراسات اللاحقة بروتوكول توليد أسماك GF ، باستخدام الطعام المعقم والأساليب المتقنة في نماذج الأسماك المختلفة16.
ومع ذلك ، فقد ركزت معظم الأبحاث حول نماذج الزرد GF على مراحل الحياة المبكرة ، والتي تنطوي على العدوى البكتيرية عند 5 dpf لمدة 24 ساعة إلى 48 ساعة ، مع العينات التي تم جمعها قبل 7 dpf في ختام التجارب25،30،31. من المعترف به على نطاق واسع أن الكائنات الحية الدقيقة في الكائنات الحية ، بما في ذلك البشر وأسماك الزرد ، يتم استعمارها في بداية الحياة وتتشكل أثناء النمو والتطور. يظل التكوين مستقرا في مراحل البلوغ ، حيث تكون أدوار الجراثيم في المضيف حاسمة طوال الحياة ، خاصة في الشيخوخة ، والتنكس العصبي ، والسمنة المرتبطة بالتمثيل الغذائي ، وجوانب الأمراض المعوية3. وبالتالي ، فإن وجهات النظر من GF ذات البقاء على قيد الحياة لفترة أطول يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لآليات الأدوار الميكروبية في تطوير الأعضاء المضيفة ووظائفها ، مع الأخذ في الاعتبار الجهاز المناعي والتناسلي غير الناضج ليرقات الأسماك في الحياة المبكرة. في حين تم عزل السلالات البكتيرية في أمعاء الزرد وتحديدها في الدراسات السابقة ، مما يوفر إمكانية إصابة النماذج الحيوانية GF لاختيار البروبيوتيك أو وظائف البكتيريا البحثية في المضيف19,25 ، فقد اقتصر توليد وتطبيق نماذج أسماك GF في المقام الأول على مراحل الحياة المبكرة. هذا القيد ، الذي يعزى إلى عملية الإنتاج المعقدة ، وارتفاع تكاليف الصيانة ، والقضايا المرتبطة بالغذاء والمناعة ، يعيق الجهود البحثية الرامية إلى التحقيق في الآثار التنموية والمزمنة للميكروبات في المضيف.
يتأثر معدل البقاء على قيد الحياة والسلوك والنمو والنضج والصحة العامة للأسماك ، خاصة في النماذج الخالية من الجراثيم (GF) ، بشكل كبير بممارسات التغذية ، بما في ذلك تناول التغذية والامتصاص خلال فترة فتح الفم من اليرقات المبكرة إلى الأحداث32،33. ومع ذلك ، فإن أحد التحديات في تربية الأسماك GF هو ندرة النظم الغذائية المعقمة المناسبة ، مما يحد من فعالية الدعم الغذائي للحفاظ على نمو اليرقات وبقائها. يعد حل هذه المشكلة أمرا بالغ الأهمية لاستعادة حياة أسماك GF ، مع الأخذ في الاعتبار آليات الدفاع التنموية وضعف قدرات الهضم بسبب عدم وجود ميكروبيوم معوي. من حيث الغذاء ، يظهر الجمبري الملحي الحي (Artemia sp.) باعتباره النظام الغذائي الأنسب لليرقات المفتوحة الفم للأسماك اليافعة. وقد لوحظ أن الأسماك التي تتغذى على الجمبري الملحي الحي تظهر معدلات نمو وبقاء أعلى مقارنة بتلك التي تتغذى على صفار البيض المطبوخ أو الطعوم الطبيعية والاصطناعيةالأخرى 34. في حين أن نماذج الحياة المبكرة لأسماك GF يمكن أن تعيش مع دعم صفار البيض ويمكن الحفاظ على نماذج يرقات GF بالتغذية المعقمة ، فإن توليد نماذج طويلة الأجل من اليرقات إلى الأحداث والوصول إلى مرحلة النضج الجنسي لا يزال يمثل تحديا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن رقائق الطعام أو المسحوق محدودة بسبب التركيب الغذائي غير المتكافئ ويمكن أن تؤثر على جودة المياه. في المقابل ، يتمتع الأرتيميا الحية بمزايا مثل البقاء على قيد الحياة في كل من المياه المالحة والعذبة ، وصغر الحجم المناسب لليرقات للبالغين ، وسهولة التجميع ، وجودة الفقس الأعلى35. بناء على الطرق السابقة16،24،30 ، قمنا بتبسيط عملية العلاج المعقدة ومعالجتنا لتحدي النظام الغذائي من خلال إنشاء GF Live Artemia sp. بسهولة كغذاء معقم لفترات أطول من أسماك GF المبكرة.
تقدم هذه الدراسة بروتوكولا محسنا يغطي (1) التوليد ، (2) الصيانة ، (3) تحديد معدل التعقيم ، و (4) الصيانة والتغذية لضمان نمو أسماك الزرد الخالية من الجراثيم (GF) من الأجنة إلى اليرقات ومراحل الأحداث. تقدم النتائج أدلة أولية على فقس وبقاء ونمو وعقم أسماك الزرد GF ، إلى جانب المؤشرات الأساسية ل GF Artemia sp. كغذاء معقم. توفر الخطوات التفصيلية في توليد النماذج وإعداد الأغذية الحية المعقمة دعما تقنيا حاسما لبناء وتطبيق نماذج أسماك GF طويلة الأجل ، بالإضافة إلى GF Artemia sp. في أبحاث التفاعل بين الميكروبات والمضيف. يتناول البروتوكول عزل البكتيريا وتحديدها والعدوى على نماذج أسماك GF ، ويحدد طرق وضع العلامات الفلورية البكتيرية ومراقبة استعمارها في أمعاء الأسماك تحت المجهر. ستخضع أسماك GF أو أسماك gnotobiotic المصابة بعدوى بكتيرية أو نماذج الجراثيم البشرية المنقولة لاكتشافات مختلفة لتوضيح وظائفها وتأثيراتها على مناعة المضيف والهضم والسلوك وتنظيم النسخ والجوانب الأيضية. على المدى الطويل ، يمكن توسيع هذا البروتوكول ليشمل أنواعا مختلفة من الأسماك البرية ، مثل الميداكا البحرية ، وربما ليشمل سلالات الزرد المعدلة وراثيا المختارة الأخرى المرتبطة بأنسجة أو أمراض معينة.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AB-GZM</td>
			<td>Amphotericin:Solarbio;&#160; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.</td>
			<td>Amphotericin:CAS:1397-89-3; 
			kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.</td>
			<td>49.6 mL GZM, 50 &#181;L amphotericin stock solution (250 &#181;g/mL), 25 &#181;L kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 &#181;L ampicillin stock solution (20 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-15-M</td>
			<td>To collect samples, and hold agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, 24-, 48- well plates</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>11112</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeronomas</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178499</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic work station</td>
			<td>GENE SCIENCE</td>
			<td>E200G</td>
			<td>Bacterial isolation, sterile testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis</td>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>v6.07</td>
			<td>To analysis the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 20 E kits</td>
			<td>&#160;BioMerieux SA, France</td>
			<td>No.1005915090</td>
			<td>Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia (Brine shrimp)</td>
			<td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td>
			<td>Aquamaster brand</td>
			<td>Artemia cysts, and brine shrimp eggs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto cycle system for fish culture</td>
			<td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Maintain the fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Zeal Way</td>
			<td>G154DWS</td>
			<td>Prepare the materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Aerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Anaerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>LongYue Co., Ltd</td>
			<td>SPX</td>
			<td>For fish and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Haier</td>
			<td>HR40-IIA2</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood plates</td>
			<td>sheep blood:Solarbio</td>
			<td>Cat. NO. TX0030</td>
			<td>Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-Dil dyes</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Cat#C7000&#160;&#160;</td>
			<td>To label the bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature shaking incubator</td>
			<td>Peiving Co., Ltd</td>
			<td>HZQ-X100</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>Bacteria and Archaea database</td>
			<td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ 
			Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pasteur pipette</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>bs-xh-03l</td>
			<td>Used to change water, and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dish</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-90-D</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA kits</td>
			<td>Solaribio</td>
			<td>Cat#D1600</td>
			<td>Bacterial genomic DNA extraction kits&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>Levo me</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiguobacterium</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178504</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZM</td>
			<td>Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pure water system</td>
			<td>Hitech Co., Ltd</td>
			<td>Prima-S15</td>
			<td>Prepare the agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>With fluorescent light to observe fish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR kits</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>Cat#ET101</td>
			<td>Taq DNA Polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>sp-013-10</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine (PVP-I)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>Lot#H1217005</td>
			<td>Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timing converter</td>
			<td>PinYi Co., Ltd</td>
			<td>AL-06</td>
			<td>To regulate the light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Aerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Anaerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clean workbench</td>
			<td>Airtech</td>
			<td>SW-CJ-2FD</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure flow system for fish culture</td>
			<td>Marine Biological Equipment company</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Produce water for fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178501</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, maintenance, and identification of germ-free zebrafish models from larvae to juvenile stages

يعمل الزرد كنماذج قيمة للبحث في النمو والمناعة وميكروبات الأمعاء بسبب أوجه التشابه الجينومية مع الثدييات ، والأجنة الشفافة التي تم تطويرها في بيئة مشيمية نظيفة نسبيا ، والتطور السريع للغاية لليرقات مقارنة بنماذج القوارض. تعتبر أسماك الزرد الخالية من الجراثيم (Danio rerio) ضرورية لتقييم سمية الملوثات وإنشاء نماذج أمراض شبيهة بالإنسان تتعلق بالوظائف الميكروبية. بالمقارنة مع النماذج التي يتم تربيتها تقليديا (CR) (الأسماك في التربية الشائعة) ، يسمح الزرد GF بمعالجة أكثر دقة للميكروبات المضيفة ، مما يساعد في تحديد العلاقة السببية بين الكائنات الحية الدقيقة والمضيفين. وبالتالي ، فإنها تلعب دورا حاسما في تعزيز فهمنا لهذه العلاقات. ومع ذلك ، عادة ما يتم إنشاء نماذج الزرد GF والبحث عنها خلال مراحل الحياة المبكرة (من الأجنة إلى اليرقات) بسبب القيود في وظيفة المناعة وامتصاص المغذيات. تعمل هذه الدراسة على تحسين توليد وصيانة وتحديد نماذج الزرد GF المبكرة دون تغذية ومع التغذية طويلة الأجل باستخدام أغذية GF (مثل Artemia sp. ، الجمبري الملحي). طوال العملية ، تم إجراء أخذ العينات اليومية والمزرعة وتحديدها من خلال عمليات الكشف المتعددة ، بما في ذلك اللوحات وتسلسل 16S rRNA. تم تسجيل معدل التعقيم والبقاء على قيد الحياة ومؤشرات النمو لسمك الزرد GF لضمان جودة وكمية النماذج التي تم إنشاؤها. الأهم من ذلك ، تقدم هذه الدراسة تفاصيل حول تقنيات العزل البكتيري والعدوى لأسماك GF ، مما يتيح إنشاء نماذج أسماك GF بكفاءة من اليرقات إلى مراحل الأحداث بدعم غذائي من GF. من خلال تطبيق هذه الإجراءات في البحوث الطبية الحيوية ، يمكن للعلماء فهم أفضل للعلاقات بين الوظائف البكتيرية المعوية وصحة المضيف.

The microbiota (i.e., Archaea, Bacteria, Eukarya, and viruses) play crucial roles in maintaining host health and contributing to the development of various diseases by influencing physiological and pathological processes through symbiotic interactions within the intestinal barrier, epithelial surface, and mucin functions in individuals1,2,3. The composition of the microbiota across different life stages, from infancy to juvenility, adulthood, and aging, as well as its presence in various locations such as nares, oral, skin, and gut sites, is dynamically shaped by diverse habitats and environments4. The intestinal microbiota in organisms is involved in nutrient absorption, immune response, pathogen invasion, metabolic regulation, etc5,6. Studies on patients have demonstrated that disruptions in gut microbiota are related to human obesity, sleep disorders, depression, inflammatory bowel disease (IBD), neurodegenerative diseases (Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s), aging, and various cancers7,8,9. Furthermore, interactive pathways between gut microbiota and hosts involve inflammatory factors, neurotransmitters, metabolites, intestinal barrier, and oxidative stress, as observed in previous research using mice and fish models10,11.
Recently, multiple bacteria-related approaches or therapies, including potential probiotics and fecal microbiota transplantation (FMT), have been explored for these disorders in clinical and animal models. These explorations are based on discoveries related to the microbiota-gut-brain/liver/kidney axis, microbiota-derived products, and altered receptor activity12,13. However, the development, various functions, and mechanisms of the microbiota-host system are still incompletely understood and identified due to the complexity of the microbial community and the challenge of generating powerful human-like disease models.
To address these issues, germ-free (GF) animal models were urgently proposed in the mid-19th century and primarily developed during the 20th century. Subsequent refinements, including antibiotic-treated and gnotobiotic models, along with advancements in microbial detection and observation technologies, further perfected these models14,15,16. GF animals, created by erasing their own background and avoiding environmental microbes, offer an excellent strategy for exploring the interactions between microorganisms and their hosts17. Through the application of animal models and refined protocols, researchers have successfully replicated similar microbial compositions found in patients in GF mice and fish. Additionally, other GF animal models, such as dogs, chickens, and pigs, provide diverse options as research subjects18,19,20,21. This approach has enabled investigations into the potential therapeutic effects of commensal microbiomes on various diseases, including cancer immunotherapy in humans16,18. GF models offer more accurate insights into the characteristics and mechanisms of specific bacterial colonization, migration, multiplication, and interaction within hosts. This provides crucial novel insights into the occurrence and development of microbiota-related diseases22,23. The history of establishing and applying GF zebrafish in microbial research has evolved from the reports of Rawls et al. in 2004 and Bates et al. in 2006 to Melancon et al.&#39;s protocol in 201716,24,25. However, the feasibility of adult or breeding GF models is still a prolonged process, accompanied by variable longevity, success rates, and health challenges.
Among various animal models, zebrafish (Danio rerio) stands out as a critical tool for both basic and biomedical research due to its advantageous similarity to human organs and genomics, short developmental cycle, high fecundity, and transparent embryos19,26. Zebrafish, serving as reliable human disease models, offer a visual representation of physiological and pathological processes in vivo, providing insights into the attractive features of host-microbe interactions. Notably, zebrafish exhibit distinct cell lineages, allowing imaging of intestinal physiology, microbial dynamics, gonads and reproductive development, maturation of the host immune system, behavior, and metabolism27. Zebrafish embryos develop within protective chorions until hatching, becoming larvae at 3 days post-fertilization (dpf). They actively hunt for food at 5 dpf and reach sexual maturity around 3 months post-fertilization (mpf)28. The first successful germ-free (GF) zebrafish, reported by Rawls et al.24, showed that larvae fed with autoclaved feed after yolk absorption exhibited tissue necrosis from 8 dpf and total death at 20 dpf. This indicated the effects of diet or the importance of considering exogenous nutrient supply in experiments involving long-term (&#62;7 dpf) GF fish29. Subsequent studies improved the generation protocol of GF fish, employing sterile food and methods perfected in different fish models16.
However, most research on GF zebrafish models has focused on early life stages, involving bacterial infection at 5 dpf for 24 h to 48 h, with samples collected before 7 dpf at the conclusion of the experiments25,30,31. It&#39;s widely acknowledged that the microbiota in organisms, including humans and zebrafish, is colonized at the beginning of life and shaped during growth and development. The composition remains stable at adult stages, with the roles of microbiota in the host being crucial throughout life, especially in aging, neurodegenerative, metabolic-related obesity, and intestinal disease aspects3. Thus, perspectives from GF animals with longer survival can provide insights into the mechanisms of microbial roles in host organ development and functions, considering the immature immune and reproductive systems of fish larvae in early life. While bacterial strains in zebrafish intestines have been isolated and identified in previous studies, offering the potential for infecting GF animal models to select probiotics or research bacterial functions in the host19,25, the generation and application of GF fish models have primarily been restricted to early life stages. This limitation, attributed to the complex production process, high maintenance costs, and associated issues with food and immunity, hinders research efforts aimed at investigating the developmental and chronic effects of microbiota in the host.
The survival rate, behavior, growth, maturation, and overall health of fish, especially in germ-free (GF) models, are significantly influenced by feeding practices, encompassing nutrition intake and absorption during the mouth-open period from early larvae to juveniles32,33. However, one of the challenges in GF fish husbandry is the scarcity of suitable sterile diets, limiting the effectiveness of nutritional support for sustaining the growth and survival of larvae. Resolving this issue is crucial to restoring the life of GF fish, considering their developmental defense mechanisms and weak digestion abilities due to the absence of an intestinal microbiome. In terms of food, live brine shrimp (Artemia sp.) emerges as the most suitable diet for mouth-open larvae to juvenile fish. It has been observed that fish fed with live brine shrimp exhibit higher growth and survival rates compared to those fed with cooked egg yolk or other natural and synthetic baits34. While early life models of GF fish can survive with yolk support and GF larvae models can be maintained with sterile feeding, generating long-term models from larvae to juveniles and reaching sexual maturity remains challenging. Additionally, flake or powder food is limited by unequal nutritional composition and can impact water quality. In contrast, live Artemia has advantages such as survival in both salt and freshwater, small size suitable for larvae to adults, ease of batching, and higher hatching quality35. Building upon previous methods16,24,30, we have simplified the complex treatment process and addressed the diet challenge by establishing easily incubated GF live Artemia sp. as sterile food for longer durations than early-life GF fish.
This study presents an optimized protocol covering (1) generation, (2) maintenance, (3) identification of sterile rate, and (4) maintenance and feeding to ensure the growth of germ-free (GF) zebrafish from embryos to larvae and juvenile stages. The results offer preliminary evidence on the hatching, survival, growth, and sterility of GF zebrafish, along with essential indices for GF Artemia sp. as sterile food. The detailed steps in model generation and preparation of sterile live foods provide crucial technical support for constructing and applying long-term GF fish models, as well as GF Artemia sp. in microbiota-host interaction research. The protocol addresses bacterial isolation, identification, and infection on GF fish models, outlining methods for bacterial fluorescence labeling and observing their colonization in fish intestines under a microscope. GF fish, gnotobiotic fish with bacterial infection, or transferred human microbiota models will undergo various detections to elucidate their functions and effects on host immunity, digestion, behavior, transcriptomic regulation, and metabolic aspects. In the long term, this protocol can be extended to different wild-type fish species, such as marine medaka, and potentially to other selected transgenic zebrafish lines correlated to specific tissues or diseases.

تسليط الضوء على المؤلف: إنشاء أسماك الزرد الخالية من الجراثيم لدراسات العلاقة بين الميكروبات والمضيف

توليد وصيانة وتحديد نماذج الزرد الخالية من الجراثيم من اليرقات إلى مراحل الأحداث

The scope of this research is generation of novel, germ-free animal models, which will be helpful and powerful tools in investigation of various microbiome functions. In this field, the early germ-free fish models have been used recently, but the long-term models are still limited due to various culture conditions and the staff developmental defense. The current GF fish models are normally early life ones.Thus, the technologies including the sterile scale, the sample detection methods, and providing sterile food are very important challenges to overcome. The germ-free zebrafish model is crucial for studying host-microbiota interaction and their impacts on development and the immunity and disease. This model allows researchers to precisely manipulate the single gut bacteria and observe its effect on the transparent zebrafish embryos.It provides valuable insights into the roles of gut microbes inheriting the disease. In the future, our research will mainly focused on establishing a germ-free zebrafish model for entire life cycle to better understanding the function of the gut microbiome.

يمكن إنتاج نماذج أسماك الزرد GF بكفاءة من خلال الاستفادة من البيض الوفير الذي تنتجه أزواج من أسماك الزرد ، مع تحسين البروتوكول بناء على نماذج أسماك GF السابقة35. يمكن للوحة واحدة مكونة من 6 آبار زراعة ما يقرب من 30-48 جنينا / يرقة ، مما يسمح بجمع بيانات وافرة وتحليل إحصائي. بعد المعال...

Watch this Scientific Journal Video about Author Spotlight: Establishing Germ-Free Zebrafish for Microbiota-Host Relationship Studies at JoVE.com

يحدد هذا البروتوكول الخطوات الأساسية للحصول على أجنة الأسماك الخالية من الجراثيم (GF) والحفاظ عليها من اليرقات حتى مرحلة الأحداث ، بما في ذلك أخذ العينات والكشف عن حالتها العقيمة. يعد استخدام نماذج GF المصابة بالعدوى أمرا مهما لفهم دور الميكروبات في صحة المضيف.

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

نطاق هذا البحث هو توليد نماذج حيوانية جديدة خالية من الجراثيم ، والتي ستكون أدوات مفيدة وقوية في التحقيق في وظائف الميكروبيوم المختلفة. في هذا المجال ، تم استخدام نماذج الأسماك المبكرة الخالية من الجراثيم مؤخرا ، لكن النماذج طويلة الأجل لا تزال محدودة بسبب ظروف الاستزراع المختلفة والدفاع التنموي للموظفين. عادة ما تكون نماذج أسماك GF الحالية نماذج الحياة المبكرة.وبالتالي ، فإن التقنيات بما في ذلك المقياس المعقم ، وطرق الكشف عن العينات ، وتوفير الطعام المعقم هي تحديات مهمة للغاية يجب التغلب عليها. يعد نموذج الزرد الخالي من الجراثيم أمرا بالغ الأهمية لدراسة تفاعل الميكروبات المضيفة وتأثيراتها على التنمية والمناعة والمرض. يسمح هذا النموذج للباحثين بمعالجة بكتيريا الأمعاء المفردة بدقة ومراقبة تأثيرها على أجنة الزرد الشفافة.يوفر رؤى قيمة حول أدوار ميكروبات الأمعاء التي ترث المرض. في المستقبل ، سيركز بحثنا بشكل أساسي على إنشاء نموذج لسمك الزرد الخالي من الجراثيم لدورة الحياة بأكملها لفهم وظيفة ميكروبيوم الأمعاء بشكل أفضل.

generation-maintenance-identification-germ-free-zebrafish-models-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

736 Views.  Chongqing Medical University. نطاق هذا البحث هو توليد نماذج حيوانية جديدة خالية من الجراثيم ، والتي ستكون أدوات مفيدة وقوية في التحقيق في وظائف الميكروبيوم المختلفة. في هذا المجال ، تم استخدام نماذج الأسماك المبكرة الخالية من الجراثيم مؤخرا ، لكن النماذج طويلة الأجل لا تزال محدودة بسبب ظروف الاستزراع ?...

Video: تسليط الضوء على المؤلف: إنشاء أسماك الزرد الخالية من الجراثيم لدراسات العلاقة بين الميكروبات والمضيف

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

Generation of Germ-Free Zebrafish Models from Embryos

جيل من نماذج الزرد الخالية من الجراثيم من الأجنة

GF Artemia nauplii Preparation for Chronic GF Zebrafish Nutrition

To begin, obtain 0.25 grams of Artemia cysts and rinse them with 2.4 grams per liter sodium hypochlorite for five minutes. Filter the rinsed cysts with a sterilized ultra dense filter and wash with sterilized ultrapure water for one to two minutes. After three washes, transfer them to 100 milliliters of 2.5%sterile saline and mix well.Pack 50 milliliters of treated Artemia cyst mix into a sterile 100-milliliter bottle. Using a film, seal the bottle thoroughly and place it in a shaking incubator with light. Next, using a Pasteur pipette, extract 30 milliliters of hatching Artemia nauplii from the middle and lower layers.After filtering, wash the Artemia three times with sterile ultrapure water for about one minute, and add four milliliters of sterile ultrapure water. Finally, using a disposable Pasteur pipette, retrieve actively swimming Artemia from the upper layer, wash, and prepare the solution for feeding. Microscopic observation confirmed efficient hatching of Artemia cysts after the treatment.