重慶医科大学人材プロジェクト(DSP第R4014号、PPJ第R4020号)、中国国家自然科学基金会(NSFC、PPJ第32200386号)、重慶ポスドク・イノベーション・メンター・スタジオ(X7928 DSP)、中国科学院(CAS)による中国・スリランカ水技術研究・実証共同センター/CASによる中国・スリランカ合同教育研究センターのプログラムからの支援に心から感謝します。

GF ゼブラフィッシュモデルの最適化:生成、維持管理、および微生物研究

GF アルテミア のプロトコルは、中国国家知識産権局から特許として付与されており、著者の許可を得た後、方法の制限された使用が緩和されます。著者らは、他に競合する利害関係や金銭的な利害関係がないことを宣言する。

GF魚とGF食品調製のプロトコル内の重要なステップ GF魚類モデルの作成中に、無菌材料の調製、胚の滅菌、GZMの毎日の更新、さまざまなサンプルの収集、複数の方法を使用した各サンプルの無菌検査など、いくつかの重要なステップが含まれていました。これらのステップの中で、胚の初期治療はGFモデルの成功にとって基本的かつ決定的です。薬剤、その濃度、および処理時?...

微生物叢(古細菌、細菌、真核生物、ウイルスなど)は、腸管関門、上皮表面、ムチン機能内の共生相互作用を通じて生理学的および病理学的プロセスに影響を与えることにより、宿主の健康を維持し、さまざまな疾患の発症に寄与する上で重要な役割を果たします1,2,3.乳児期から若年期、成人期、老化までのさまざまなライフステージにわたる微生物叢の構成、および鼻、口腔、皮膚、腸の部位などのさまざまな場所での存在は、多様な生息地と環境によって動的に形成されます4。生物の腸内細菌叢は、栄養素の吸収、免疫応答、病原体の侵入、代謝調節などに関与しています5,6。患者を対象とした研究では、腸内細菌叢の破壊が人間の肥満、睡眠障害、うつ病、炎症性腸疾患(IBD)、神経変性疾患(パーキンソン病、アルツハイマー病)、老化、およびさまざまな癌に関連していることが実証されています7,8,9。さらに、腸内細菌叢と宿主の間の相互作用経路には、マウスと魚のモデルを使用した以前の研究で観察されたように、炎症因子、神経伝達物質、代謝物、腸バリア、および酸化ストレスが含まれます10,11。
最近、潜在的なプロバイオティクスや糞便微生物叢移植(FMT)を含む複数の細菌関連のアプローチまたは治療法が、臨床および動物モデルでこれらの障害について調査されています。これらの調査は、微生物叢-腸-脳/肝臓/腎臓軸、微生物叢由来の産物、および受容体活性の変化に関連する発見に基づいています12,13。しかし、微生物叢-宿主システムの発生、さまざまな機能、およびメカニズムは、微生物群集の複雑さと強力なヒト様疾患モデルの生成という課題のために、まだ完全に理解および特定されていません。
これらの問題に対処するために、無菌(GF)動物モデルが19世紀半ばに緊急に提案され、主に20世紀に開発されました。抗生物質処理モデルやノノトバイオティクスモデルなどのその後の改良と、微生物の検出および観察技術の進歩により、これらのモデルはさらに完成しました14,15,16。GF動物は、自身の背景を消し去り、環境微生物を避けて作られており、微生物とその宿主との相互作用を探るための優れた戦略を提供している17。動物モデルと洗練されたプロトコルの適用により、研究者はGFマウスと魚の患者に見られる同様の微生物組成を再現することに成功しました。さらに、イヌ、ニワトリ、ブタなどの他のGF動物モデルは、研究対象として多様な選択肢を提供する18,19,20,21。このアプローチにより、ヒトの癌免疫療法を含むさまざまな疾患に対する共生微生物叢の潜在的な治療効果の調査が可能になりました16,18。GFモデルは、宿主内の特定の細菌のコロニー形成、移動、増殖、相互作用の特性とメカニズムについて、より正確な洞察を提供します。これは、微生物叢関連疾患の発生と発症に関する重要な新しい洞察を提供します22,23。GFゼブラフィッシュを微生物研究に確立し、応用してきた歴史は、2004年のRawlsらと2006年のBatesらの報告から、2017年のMelancon et al.のプロトコルへと発展してきました16,24,25。しかし、成体または繁殖GFモデルの実現可能性は、依然として長期にわたるプロセスであり、寿命、成功率、および健康上の課題にばらつきがあります。
さまざまな動物モデルの中で、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、ヒトの臓器やゲノミクスとの有利な類似性、短い発生サイクル、高い繁殖力、および透明な胚により、基礎研究と生物医学研究の両方にとって重要なツールとして際立っています19,26。ゼブラフィッシュは、信頼性の高いヒト疾患モデルとして機能し、生体内の生理学的および病理学的プロセスを視覚的に表現し、宿主と微生物の相互作用の魅力的な特徴に関する洞察を提供します。特に、ゼブラフィッシュは異なる細胞系譜を示し、腸の生理機能、微生物の動態、生殖腺と生殖発達、宿主の免疫系の成熟、行動、代謝のイメージングを可能にします27。ゼブラフィッシュの胚は、孵化するまで保護絨毛膜内で発生し、受精後3日(dpf)で幼生になります。彼らは5 dpfで積極的に餌を探し、受精後約3か月(mpf)で性的成熟に達します28。Rawlsらによって報告された最初の無菌(GF)ゼブラフィッシュは、卵黄吸収後にオートクレーブ飼料を与えられた幼虫が8dpfからの組織壊死と20dpfで全死を示したことを示しました。これは、食事の影響、または長期(>7 dpf)GF魚29を含む実験における外因性の栄養素供給を考慮することの重要性を示しました。その後の研究は、GF魚の生成プロトコルを改善し、無菌食品とさまざまな魚モデルで完成された方法を採用しました16。
しかし、GFゼブラフィッシュモデルに関するほとんどの研究は、5dpfで24時間から48時間にわたって細菌感染を含む初期ライフステージに焦点を当てており、実験25,30,31の終わりに7dpfより前にサンプルが収集されました。ヒトやゼブラフィッシュなどの生物の微生物叢は、生命の初めにコロニーを形成し、成長と発達の過程で形成されることは広く認められています。組成は成虫の段階で安定しており、宿主における微生物叢の役割は、特に老化、神経変性、代謝関連肥満、および腸疾患の側面において、生涯を通じて重要です3。したがって、生存期間の長いGF動物からの視点は、初期生活における魚の幼生の未熟な免疫系と生殖系を考慮して、宿主器官の発生と機能における微生物の役割のメカニズムへの洞察を提供することができます。ゼブラフィッシュの腸内の細菌株は、以前の研究で単離され、同定されており、GF動物モデルに感染してプロバイオティクスを選択したり、宿主の細菌機能を研究したりする可能性があります19,25が、GF魚類モデルの生成と応用は、主に初期のライフステージに限定されています。この制限は、複雑な生産プロセス、高い維持費、および食物と免疫に関連する問題に起因し、宿主における微生物叢の発生的および慢性的な影響を調査することを目的とした研究努力を妨げています。
魚の生存率、行動、成長、成熟、および全体的な健康状態は、特に無菌(GF)モデルでは、初期の幼虫から幼魚までの口を開けた期間中の栄養摂取と吸収を含む摂食慣行に大きく影響されます32,33。しかし、GFの養殖における課題の1つは、適切な無菌食が不足しており、幼虫の成長と生存を維持するための栄養サポートの有効性が制限されていることです。この問題を解決することは、GF魚の発生防御機構と腸内細菌叢の欠如による消化能力の弱さを考慮すると、GF魚の生命を回復するために重要です。食物の面では、生きたブラインシュリンプ(Artemia sp.)が、口を開けた幼魚から稚魚に最も適した餌として浮上しています。生きたブラインシュリンプを与えられた魚は、調理された卵黄または他の天然および合成餌を与えられた魚と比較して、より高い成長率と生存率を示すことが観察されている34。GF魚の初期の生命モデルは卵黄のサポートで生き残ることができ、GF幼虫モデルは無菌摂食で維持できますが、幼虫から幼魚までの長期モデルを生成し、性的成熟に達することは依然として困難です。さらに、フレークや粉末状の食品は、栄養組成の不均一によって制限され、水質に影響を与える可能性があります。対照的に、生きたアルテミアは、塩水と淡水の両方での生存、幼虫から成虫に適した小型、バッチ処理の容易さ、孵化品質の向上などの利点があります35。以前の方法16,24,30に基づいて、複雑な処理プロセスを簡素化し、初期のGF魚よりも長期間無菌食品として容易にインキュベートできるGF生きたアルテミアsp.を確立することにより、食事の課題に対処しました。
この研究では、胚から幼生および幼魚期までの無菌(GF)ゼブラフィッシュの成長を確実にするための、(1)生成、(2)維持管理、(3)不妊率の特定、および(4)維持管理と給餌をカバーする最適化されたプロトコルを提示します。この結果は、GFゼブラフィッシュの孵化、生存、成長、および不妊性に関する予備的な証拠と、無菌食品としてのGF アルテミア sp.の重要な指標を提供します。無菌生食品のモデル生成と調製の詳細な手順は、長期的なGF魚モデルの構築と適用、および微生物叢と宿主の相互作用研究におけるGF アルテミア sp.の重要な技術サポートを提供します。このプロトコルは、GF魚類モデルでの細菌の分離、同定、および感染に対処し、細菌の蛍光標識の方法を概説し、顕微鏡下で魚の腸内でのコロニー形成を観察します。GF魚類、細菌感染したノトバイオティクス魚類、または移植されたヒト微生物叢モデルは、宿主免疫、消化、行動、トランスクリプトーム調節、および代謝面に対するそれらの機能と影響を解明するために、さまざまな検出を受けます。長期的には、このプロトコルは、海洋メダカなどのさまざまな野生型魚種に拡張することができ、場合によっては、特定の組織や疾患に関連する他の選択されたトランスジェニックゼブラフィッシュ系統にも拡張できます。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>AB-GZM</td>
			<td>Amphotericin:Solarbio;&#160; kanamycin:Solarbio; Ampicillin:Solarbio.</td>
			<td>Amphotericin:CAS:1397-89-3; 
			kanamycin:CAS: 25380-94-0; Ampicillin:CAS: 69-52-313.</td>
			<td>49.6 mL GZM, 50 &#181;L amphotericin stock solution (250 &#181;g/mL), 25 &#181;L kanamycin stock solution (10 mg/mL), and 250 &#181;L ampicillin stock solution (20 mg/mL).</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.5 mL, 15 mL, 50 mL EP tubes</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-15-M</td>
			<td>To collect samples, and hold agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plates, 24-, 48- well plates</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>11112</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aeronomas</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178499</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>The TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, and 6 g agar powder under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anaerobic work station</td>
			<td>GENE SCIENCE</td>
			<td>E200G</td>
			<td>Bacterial isolation, sterile testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Analysis</td>
			<td>GraphPad Prism 5</td>
			<td>v6.07</td>
			<td>To analysis the data</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>API 20 E kits</td>
			<td>&#160;BioMerieux SA, France</td>
			<td>No.1005915090</td>
			<td>Ref 20100 Kits to detect bacterial metabolism</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Artemia (Brine shrimp)</td>
			<td>Shangjia Aquarium Co., Ltd.</td>
			<td>Aquamaster brand</td>
			<td>Artemia cysts, and brine shrimp eggs&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Auto cycle system for fish culture</td>
			<td>Ningbo Hairui Technology Co., Ltd</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Maintain the fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td>Zeal Way</td>
			<td>G154DWS</td>
			<td>Prepare the materials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Aerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared, wherein 100 mL medium included 3.7 g BHI powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BHI Anaerobic</td>
			<td>Coolaber</td>
			<td>Cat#PM0640</td>
			<td>BHI medium was prepared and divided into anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biochemical incubator</td>
			<td>LongYue Co., Ltd</td>
			<td>SPX</td>
			<td>For fish and plates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosafety cabinet</td>
			<td>Haier</td>
			<td>HR40-IIA2</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleaching agent of 0.02 g/L NaClO</td>
			<td>XILONG SCIENTIFIC Co., Ltd.</td>
			<td>CAS: 7681-52-9</td>
			<td>Working solution with sodium hypochlorite (NaClO) concentration: Diluted with 8% sodium hypochlorite aqueous solution or 166.6 uL 6% sodium hypochlorite with 500 mL distilled water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood plates</td>
			<td>sheep blood:Solarbio</td>
			<td>Cat. NO. TX0030</td>
			<td>Sterile-defibrinated sheep blood was added into TSA to prepare 5% blood plates.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture flask</td>
			<td>Corning</td>
			<td>430639</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM-Dil dyes</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>Cat#C7000&#160;&#160;</td>
			<td>To label the bacteria</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Constant temperature shaking incubator</td>
			<td>Peiving Co., Ltd</td>
			<td>HZQ-X100</td>
			<td>Bacterial culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Database</td>
			<td>NCBI</td>
			<td>Bacteria and Archaea database</td>
			<td>Link: Archaea FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Archaea/ 
			Bacteria FTP: ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/TargetedLoci/Bacteria/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable Pasteur pipette</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>bs-xh-03l</td>
			<td>Used to change water, and transfer eggs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable petri dish</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-90-D</td>
			<td>To culture fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNA kits</td>
			<td>Solaribio</td>
			<td>Cat#D1600</td>
			<td>Bacterial genomic DNA extraction kits&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electric pipette</td>
			<td>SCILOGEX</td>
			<td>Levo me</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exiguobacterium</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178504</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GZM</td>
			<td>Sea salt:LANDEBAO Co., Ltd.</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Composed of 1 L of water and 1.5 mL of sea salt solution (40 g/L), autoclaved. The content of sea salt in the GZM solution was 60 mg/L.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory pure water system</td>
			<td>Hitech Co., Ltd</td>
			<td>Prima-S15</td>
			<td>Prepare the agents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>SMZ18</td>
			<td>With fluorescent light to observe fish larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR kits</td>
			<td>TIANGEN</td>
			<td>Cat#ET101</td>
			<td>Taq DNA Polymerase kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette</td>
			<td>LABSELECT&#160;</td>
			<td>sp-013-10</td>
			<td>Change water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Povidone iodine (PVP-I)</td>
			<td>Aladdin</td>
			<td>Lot#H1217005</td>
			<td>Aqueous solution povidone iodine 0.4 g/L pure water.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Timing converter</td>
			<td>PinYi Co., Ltd</td>
			<td>AL-06</td>
			<td>To regulate the light</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSA plates</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp; 
			agar powder:BioFroxx.</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112; 
			agar powder:9002-18-0.</td>
			<td>TSA plates were prepared with 400 mL medium containing 6 g tryptone, 2 g soy peptone, 2 g NaCl, 6 g agar powder.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Aerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared, wherein 400 mL medium included 6 g tryptone, 2 g soy peptone, and 2 g NaCl.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TSB Anaerobic</td>
			<td>tryptone:Oxoid ; 
			soy peptone:Solarbio ;NaCl:Biosharp;</td>
			<td>tryptone:LP0042B; 
			soy peptone:Cat#S9500; 
			NaCl:BS112;</td>
			<td>TSB medium was prepared and divided into the anaerobic tubes under the anaerobic system.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-clean workbench</td>
			<td>Airtech</td>
			<td>SW-CJ-2FD</td>
			<td>Sterile treatment and testing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra-pure flow system for fish culture</td>
			<td>Marine Biological Equipment company</td>
			<td>No Cat</td>
			<td>Produce water for fish</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vibrio</td>
			<td>NCBI database</td>
			<td>No.MK178501</td>
			<td>2019-JPP-ESN</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation, maintenance, and identification of germ-free zebrafish models from larvae to juvenile stages

ゼブラフィッシュは、哺乳類とのゲノムの類似性、比較的きれいな絨毛膜環境で発達した透明な胚、およびげっ歯類モデルと比較して幼虫の非常に速い発育により、成長、免疫、および腸内細菌叢の研究にとって貴重なモデルとして機能します。無菌(GF)ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は、汚染物質の毒性を評価し、微生物機能に関連するヒト様疾患モデルを確立するために重要です。従来の飼育(CR)モデル(一般的な飼育の魚)と比較して、GFゼブラフィッシュは宿主微生物叢をより正確に操作することができ、微生物と宿主の因果関係を決定するのに役立ちます。その結果、これらの関係の理解を深める上で重要な役割を果たします。しかし、GFゼブラフィッシュモデルは、免疫機能と栄養素の吸収に限界があるため、通常、初期の生活段階(胚から幼生まで)に生成および研究されています。この研究は、GFフード( アルテミア 属、ブラインシュリンプなど)を使用して、給餌なしおよび長期給餌による初期のGFゼブラフィッシュモデルの生成、維持、および同定を最適化します。プロセス全体を通して、毎日のサンプリングと培養が行われ、プレートや16S rRNAシーケンシングなどの複数の検出によって同定されました。GFゼブラフィッシュの無菌率、生存率、および発生指数を記録して、生成されたモデルの質と量を確保しました。重要なことに、この研究はGF魚の細菌分離と感染技術の詳細を提供し、GF食物サポートを使用して幼生から幼魚期までのGF魚モデルを効率的に作成できるようにします。これらの手順を生物医学研究に適用することにより、科学者は腸内細菌機能と宿主の健康との関係をよりよく理解することができます。

The microbiota (i.e., Archaea, Bacteria, Eukarya, and viruses) play crucial roles in maintaining host health and contributing to the development of various diseases by influencing physiological and pathological processes through symbiotic interactions within the intestinal barrier, epithelial surface, and mucin functions in individuals1,2,3. The composition of the microbiota across different life stages, from infancy to juvenility, adulthood, and aging, as well as its presence in various locations such as nares, oral, skin, and gut sites, is dynamically shaped by diverse habitats and environments4. The intestinal microbiota in organisms is involved in nutrient absorption, immune response, pathogen invasion, metabolic regulation, etc5,6. Studies on patients have demonstrated that disruptions in gut microbiota are related to human obesity, sleep disorders, depression, inflammatory bowel disease (IBD), neurodegenerative diseases (Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s), aging, and various cancers7,8,9. Furthermore, interactive pathways between gut microbiota and hosts involve inflammatory factors, neurotransmitters, metabolites, intestinal barrier, and oxidative stress, as observed in previous research using mice and fish models10,11.
Recently, multiple bacteria-related approaches or therapies, including potential probiotics and fecal microbiota transplantation (FMT), have been explored for these disorders in clinical and animal models. These explorations are based on discoveries related to the microbiota-gut-brain/liver/kidney axis, microbiota-derived products, and altered receptor activity12,13. However, the development, various functions, and mechanisms of the microbiota-host system are still incompletely understood and identified due to the complexity of the microbial community and the challenge of generating powerful human-like disease models.
To address these issues, germ-free (GF) animal models were urgently proposed in the mid-19th century and primarily developed during the 20th century. Subsequent refinements, including antibiotic-treated and gnotobiotic models, along with advancements in microbial detection and observation technologies, further perfected these models14,15,16. GF animals, created by erasing their own background and avoiding environmental microbes, offer an excellent strategy for exploring the interactions between microorganisms and their hosts17. Through the application of animal models and refined protocols, researchers have successfully replicated similar microbial compositions found in patients in GF mice and fish. Additionally, other GF animal models, such as dogs, chickens, and pigs, provide diverse options as research subjects18,19,20,21. This approach has enabled investigations into the potential therapeutic effects of commensal microbiomes on various diseases, including cancer immunotherapy in humans16,18. GF models offer more accurate insights into the characteristics and mechanisms of specific bacterial colonization, migration, multiplication, and interaction within hosts. This provides crucial novel insights into the occurrence and development of microbiota-related diseases22,23. The history of establishing and applying GF zebrafish in microbial research has evolved from the reports of Rawls et al. in 2004 and Bates et al. in 2006 to Melancon et al.&#39;s protocol in 201716,24,25. However, the feasibility of adult or breeding GF models is still a prolonged process, accompanied by variable longevity, success rates, and health challenges.
Among various animal models, zebrafish (Danio rerio) stands out as a critical tool for both basic and biomedical research due to its advantageous similarity to human organs and genomics, short developmental cycle, high fecundity, and transparent embryos19,26. Zebrafish, serving as reliable human disease models, offer a visual representation of physiological and pathological processes in vivo, providing insights into the attractive features of host-microbe interactions. Notably, zebrafish exhibit distinct cell lineages, allowing imaging of intestinal physiology, microbial dynamics, gonads and reproductive development, maturation of the host immune system, behavior, and metabolism27. Zebrafish embryos develop within protective chorions until hatching, becoming larvae at 3 days post-fertilization (dpf). They actively hunt for food at 5 dpf and reach sexual maturity around 3 months post-fertilization (mpf)28. The first successful germ-free (GF) zebrafish, reported by Rawls et al.24, showed that larvae fed with autoclaved feed after yolk absorption exhibited tissue necrosis from 8 dpf and total death at 20 dpf. This indicated the effects of diet or the importance of considering exogenous nutrient supply in experiments involving long-term (&#62;7 dpf) GF fish29. Subsequent studies improved the generation protocol of GF fish, employing sterile food and methods perfected in different fish models16.
However, most research on GF zebrafish models has focused on early life stages, involving bacterial infection at 5 dpf for 24 h to 48 h, with samples collected before 7 dpf at the conclusion of the experiments25,30,31. It&#39;s widely acknowledged that the microbiota in organisms, including humans and zebrafish, is colonized at the beginning of life and shaped during growth and development. The composition remains stable at adult stages, with the roles of microbiota in the host being crucial throughout life, especially in aging, neurodegenerative, metabolic-related obesity, and intestinal disease aspects3. Thus, perspectives from GF animals with longer survival can provide insights into the mechanisms of microbial roles in host organ development and functions, considering the immature immune and reproductive systems of fish larvae in early life. While bacterial strains in zebrafish intestines have been isolated and identified in previous studies, offering the potential for infecting GF animal models to select probiotics or research bacterial functions in the host19,25, the generation and application of GF fish models have primarily been restricted to early life stages. This limitation, attributed to the complex production process, high maintenance costs, and associated issues with food and immunity, hinders research efforts aimed at investigating the developmental and chronic effects of microbiota in the host.
The survival rate, behavior, growth, maturation, and overall health of fish, especially in germ-free (GF) models, are significantly influenced by feeding practices, encompassing nutrition intake and absorption during the mouth-open period from early larvae to juveniles32,33. However, one of the challenges in GF fish husbandry is the scarcity of suitable sterile diets, limiting the effectiveness of nutritional support for sustaining the growth and survival of larvae. Resolving this issue is crucial to restoring the life of GF fish, considering their developmental defense mechanisms and weak digestion abilities due to the absence of an intestinal microbiome. In terms of food, live brine shrimp (Artemia sp.) emerges as the most suitable diet for mouth-open larvae to juvenile fish. It has been observed that fish fed with live brine shrimp exhibit higher growth and survival rates compared to those fed with cooked egg yolk or other natural and synthetic baits34. While early life models of GF fish can survive with yolk support and GF larvae models can be maintained with sterile feeding, generating long-term models from larvae to juveniles and reaching sexual maturity remains challenging. Additionally, flake or powder food is limited by unequal nutritional composition and can impact water quality. In contrast, live Artemia has advantages such as survival in both salt and freshwater, small size suitable for larvae to adults, ease of batching, and higher hatching quality35. Building upon previous methods16,24,30, we have simplified the complex treatment process and addressed the diet challenge by establishing easily incubated GF live Artemia sp. as sterile food for longer durations than early-life GF fish.
This study presents an optimized protocol covering (1) generation, (2) maintenance, (3) identification of sterile rate, and (4) maintenance and feeding to ensure the growth of germ-free (GF) zebrafish from embryos to larvae and juvenile stages. The results offer preliminary evidence on the hatching, survival, growth, and sterility of GF zebrafish, along with essential indices for GF Artemia sp. as sterile food. The detailed steps in model generation and preparation of sterile live foods provide crucial technical support for constructing and applying long-term GF fish models, as well as GF Artemia sp. in microbiota-host interaction research. The protocol addresses bacterial isolation, identification, and infection on GF fish models, outlining methods for bacterial fluorescence labeling and observing their colonization in fish intestines under a microscope. GF fish, gnotobiotic fish with bacterial infection, or transferred human microbiota models will undergo various detections to elucidate their functions and effects on host immunity, digestion, behavior, transcriptomic regulation, and metabolic aspects. In the long term, this protocol can be extended to different wild-type fish species, such as marine medaka, and potentially to other selected transgenic zebrafish lines correlated to specific tissues or diseases.

著者スポットライト:微生物叢と宿主の関係研究のための無菌ゼブラフィッシュの確立

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

The scope of this research is generation of novel, germ-free animal models, which will be helpful and powerful tools in investigation of various microbiome functions. In this field, the early germ-free fish models have been used recently, but the long-term models are still limited due to various culture conditions and the staff developmental defense. The current GF fish models are normally early life ones.Thus, the technologies including the sterile scale, the sample detection methods, and providing sterile food are very important challenges to overcome. The germ-free zebrafish model is crucial for studying host-microbiota interaction and their impacts on development and the immunity and disease. This model allows researchers to precisely manipulate the single gut bacteria and observe its effect on the transparent zebrafish embryos.It provides valuable insights into the roles of gut microbes inheriting the disease. In the future, our research will mainly focused on establishing a germ-free zebrafish model for entire life cycle to better understanding the function of the gut microbiome.

GFゼブラフィッシュモデルは、ゼブラフィッシュのつがいで産む豊富な卵を利用することで効率的に作製することができ、従来のGF魚類モデル35に基づいてプロトコルを最適化した。1枚の6ウェルプレートで約30〜48個の胚/幼虫を培養できるため、十分なデータ収集と統計分析が可能です。無菌処理後、GF胚は48〜72時間で幼虫に孵化するまで清潔なインキュベーターで培養され...

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このプロトコルは、無菌(GF)魚の胚を取得し、幼虫から幼魚期まで維持するための主要な手順を概説しています。感染に対するGFモデルの使用は、宿主の健康における微生物の役割を理解するために重要です。

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

この研究の範囲は、さまざまなマイクロバイオーム機能の調査に役立つ強力なツールとなる、新しい無菌動物モデルの生成です。この分野では、最近、初期の無菌魚モデルが用いられているが、様々な養殖条件やスタッフの発達防御のために、長期モデルはまだ限られている。現在のGF魚のモデルは通常、初期のものです。したがって、無菌スケール、サンプル検出方法、無菌食品の提供などの技術は、克服すべき非常に重要な課題です。無菌ゼブラフィッシュモデルは、宿主と微生物叢の相互作用と、それらが発生や免疫、病気に与える影響を研究するために重要です。このモデルにより、研究者は単一の腸内細菌を正確に操作し、透明なゼブラフィッシュの胚への影響を観察することができます。この研究は、この病気を受け継ぐ腸内微生物の役割について貴重な洞察を与えてくれます。今後は、腸内細菌叢の機能をより深く理解するために、ライフサイクル全体にわたる無菌ゼブラフィッシュモデルの確立を主な研究テーマとしています。

generation-maintenance-identification-germ-free-zebrafish-models-from

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

696 ビュー.  Chongqing Medical University. この研究の範囲は、さまざまなマイクロバイオーム機能の調査に役立つ強力なツールとなる、新しい無菌動物モデルの生成です。この分野では、最近、初期の無菌魚モデルが用いられているが、様々な養殖条件やスタッフの発達防御のために、長期モデルはまだ限られている。現在のGF魚のモデルは通常、初期のものです。したがって、無菌スケール、サンプル検?...