يرتبط الخلل الوظيفي في الميتوكوندريا بالعديد من الأمراض ، وخاصة الاضطرابات التنكسية العصبية والتمثيل الغذائي. لذلك ، إذا تمكنا من فهم كيفية تنظيم الميتوكوندريا بواسطة الجسيمات الحالة ، فهذا يساعد على تطوير استراتيجيات علاجية جديدة. في هذا البروتوكول ، أظهرنا طريقة CLEM ثنائية اللون لتصور ملامسة الجسيم الليزومي للميتوكوندريا.
الضوء المترابط والفحص المجهري الإلكتروني هو تقنية تصوير تجمع بين مزايا الفحص المجهري الضوئي والفحص المجهري الإلكتروني. في هذا البروتوكول ، نعمل على زيادة ميزة CLEM باستخدام مجسات ثنائية اللون لتصور ملامسة الليزوسوم في الميتوكوندريا. من الصعب التمييز بوضوح بين الميتوكوندريا المتدهورة داخل الجسيمات الحالة باستخدام طرق أخذ العينات المجهرية الإلكترونية التقليدية.
تقدم هذه الدراسة نتيجة CLEM عالية الدقة أظهرت بوضوح المجال المستجيب للليزوسومات والميتوكوندريا. تم استخدام طريقة أخذ اللون المزدوج للتمييز بدقة بين مؤثرات الميتوكوندريا داخل الجسيمات الحالة كشف بحثنا أن الميتوكوندريا تتفاعل مع الجسيمات الحالة.
كشف بحثنا أن الميتوكوندريا تفاعلت مع الجسيمات الحالة بطرق مختلفة استجابة للضغوط الخارجية المختلفة. من خلال دراسة أسباب ومنظمي هذه الظواهر ، سنكتسب نظرة ثاقبة لفهم مراقبة جودة الميتوكوندريا داخل الخلايا. للبدء ، قم بزراعة خلايا HeLa بكثافة واحدة في 10 أس خمسة في أطباق ثقافة شبكية زجاجية مقاس 35 ملم.
في اليوم التالي ، قم بنقل الخلايا بشكل مشترك عند التقاء 30٪ إلى 40٪ مع البلازميدات باستخدام كاشف التعداد. بعد التعدي ، عالج الخلايا بثنائي ميثيل سلفوكسيد أو U18666A والبافيلوميسين A1 لمدة 18 ساعة. للتصوير متحد البؤر ، قم بإزالة وسائط الثقافة وأضف على الفور 250 ميكرولتر من محلول التثبيت الدافئ عند 30 إلى 37 درجة مئوية.
قم بإزالة المثبت على الفور. استبدلها ب 1.5 مل من المثبت الطازج واحتضانها على الثلج لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل الخلايا ثلاث مرات لمدة 10 دقائق كل منها بمليلتر واحد من محلول كاكوديلات الصوديوم المثلج 0.1 مولار.
بعد ذلك ، أضف ملليلترا واحدا من محلول الجلايسين البارد سعة 20 ملليمولار لإخماد الألدهيد. بعد احتضان الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق ، اغسلها ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها في محلول كاكوديلات الصوديوم البارد 0.1 مولار. ثم أضف 500 ميكرولتر من محلول Amplex الأحمر إلى طبق العينة واحتضنه لمدة خمس دقائق على الثلج.
بعد ذلك ، قم بإزالة محلول Amplex الأحمر واشطف الخلايا ثلاث مرات لمدة 10 دقائق لكل منها بمحلول كاكوديلات الصوديوم 0.1 مولار. استخدم مجهريا متحد البؤر لتصوير المنطقة المحيطة بالخلايا ذات الأهمية في وضع مسح البلاط ثلاثة × ثلاثة. التقط كلا من تباين التداخل التفاضلي وإشارات الفلورسنت لتحديد وتسجيل الشبكة والحروف على طبق الشبكة باستخدام هدف 40 مرة.
قم بتصوير الخلايا المستهدفة بتكبير عال باستخدام هدف 40 مرة واحصل على صورة Z-stack. بعد تصوير خلايا Amplex الملطخة باللون الأحمر باستخدام مجهر متحد البؤر ، أضف ملليلترا واحدا من رابع أكسيد الأوزميوم المخفض بنسبة 1٪ عند أربع درجات مئوية واحتضنه لمدة ساعة واحدة. ثم اشطف العينة ثلاث مرات لمدة 10 دقائق كل منها بالماء المقطر عند أربع درجات مئوية.
يجفف في سلسلة الإيثانول المتدرجة لمدة 15 دقيقة في كل مرة في درجة حرارة الغرفة. الآن امزج الإيثانول مع راتنجات الايبوكسي بنسب حجم من ثلاثة إلى واحد ، واحد إلى واحد ، وواحد إلى ثلاثة ، مع إعداد ما مجموعه 300 ميكرولتر من كل خليط. يسكب كل خليط راتنجات الايبوكسي في الطبق ويحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة.
بعد ذلك ، قم بإعداد كبسولة التضمين عن طريق ملئها براتنجات الايبوكسي الطازجة. اقلب الأنبوب أو الكبسولة رأسا على عقب في المنطقة التي تهمك وضعه في فرن على حرارة 60 درجة مئوية لمدة 48 ساعة حتى يتبلمر. ثم اغمر الزجاج السفلي وكتلة البوليمر في النيتروجين السائل لفصلهما.
ضع كتلة العينة في حامل العينة من الميكروتوم الفائق وضعه في كتلة التشذيب. استخدم شفرة حلاقة لتقليم الراتنج إلى شكل مستطيل أو شبه منحرف حول الكائن محل الاهتمام. ضع كتلة العينة المشذبة في حامل العينة واضبط الشفرة الماسية.
باستخدام ميكروتوم فائق ، قم بقطع أقسام رفيعة للغاية على بعد حوالي 60 إلى 70 نانومتر من الخلايا المدمجة المسطحة. اجمع الأقسام التسلسلية على شبكة فتحة مطلية بالفورفار قبل تجفيفها على طبق ساخن. بعد ذلك ، قم بتلطيخ الأقسام بصبغة التباين لمدة دقيقتين وقم بتغطية سترات الرصاص لمدة دقيقة واحدة.
ثم ضع الشبكة في المجهر الإلكتروني للإرسال ، أو TEM ، حامل العينة للمراقبة. استنادا إلى صورة تباين التداخل التفاضلي من المجهر الضوئي ، حدد الخلية المستهدفة ذات الأهمية وصور منطقة الخلية بأكملها باستخدام صور متداخلة متجانبة عند تكبير 1 ، 700 مرة للحصول على صور المجهرية الضوئية والإلكترونية المترابطة لخلايا HeLa باستخدام ImageJ Fiji ، ابدأ ImageJ Fiji وانقر على ملف ، جديد ، TrakEM2 فارغ ، وحدد مجلد التخزين لإنشاء مشروع TrakEM2 جديد. اسحب بيانات صورة التجانب الأولية وأفلتها في مساحة العمل لفتح مجموعة بيانات صورة التجانب.
انقر فوق زر الماوس الأيمن وحدد الخط ومونتاج جميع الصور في هذه الطبقة ومراسلات الكتل غير الخطية المرنة. ثم انقر فوق موافق لقبول القيم الافتراضية للمعلمات المتبقية. بعد ذلك ، انقر فوق زر الماوس الأيمن وحدد تصدير ، متبوعا بإنشاء صورة مسطحة لإنشاء صورة مخيطة.
ثم انقر فوق ملف واحفظه باسم لحفظ الصورة. لتغيير حجم الصورة الفلورية، افتح برنامج تكبير الصور. انقر فوق ملف ، وافتح الصورة وحددها.
أدخل العرض والارتفاع. لمطابقة حجم صورة المجهر الإلكتروني. حدد الخوارزمية المراد تطبيقها في طريقة تغيير الحجم.
انقر فوق ملف واحفظه لحفظ الصورة التي تم تغيير حجمها. افتح ImageJ Fiji واسحب وأفلت التألق الذي تم تغيير حجمه والصورة المجهرية الإلكترونية المخيطة في مساحة العمل. انقر فوق المكونات الإضافية عارض البيانات الضخمة والاعوجاج الكبير لبدء التسجيل.
ثم انقر فوق القائمة المنسدلة لتحديد صورة الميكروغراف الفلوري كصورة متحركة وصورة المجهر الإلكتروني كصورة مستهدفة. باستخدام وظائف مثل التكبير / التصغير وتدوير الصورة والتحرك ، قارن بين الصور المجهرية المضان والإلكترون. اضغط على مفتاح المسافة على لوحة المفاتيح للتبديل إلى وضع المعالم واضغط على زر الماوس الأيسر لتمييز ثلاثة معالم على الأقل تم تحديدها في كلتا الصورتين.
بعد وضع علامة على جميع المعالم المحددة ، انتقل إلى ملف ، وتصدير الصورة المتحركة ، وانقر فوق موافق. ستظهر نافذة منبثقة جديدة مع صورة الرسم المجهري الفلوري المحولة. انقر فوق الملف واحفظه لحفظ صورة الميكروغراف الفلورية المحولة.
لتراكب صور CLEM ، اسحب وأفلت صورة الميكروغراف المجهري الفلوري المحولة وصورة المجهر الإلكتروني المخيط في مساحة عمل ImageJ. انقر فوق الصورة والنوع واللون ثمانية بت. لتعيين نفس نوع الصورة لكل من الصور المجهرية الفلورية والإلكترونية.
انقر فوق الصورة واللون ودمج القنوات. لدمج الصور. انقر فوق ملف واحفظه لحفظ صورة CLEM.
لوحظت الميتوكوندريا المحاصرة داخل الجسيمات الحالة في الخلايا المعالجة بالبافيلومايسين A1 مما يشير إلى تثبيط الالتهام الذاتي وانخفاض جودة الميتوكوندريا ، بينما أظهرت خلايا التحكم الميتوكوندريا تتفاعل مع الجسيمات الحالة ولكن لم تغمرها ، أظهر اضطراب الميتوكوندريا الذي لوحظ في خلايا التحكم أن الميتوكوندريا تحيط بالليزوسومات بدلا من أن تغمرها. أظهرت الخلايا المعالجة U18666A تفاعلات متزايدة بين الميتوكوندريا والليزوزومات ، مع ابتلاع بعض الجسيمات الحالة بواسطة الميتوكوندريا.
