Дисфункция митохондрий связана со многими заболеваниями, в частности с нейродегенеративными и метаболическими нарушениями. Поэтому, если мы сможем понять, как митохондрии регулируются лизосомами, это поможет разработать новые терапевтические стратегии. В этом протоколе мы продемонстрировали двухцветный метод CLEM для визуализации контакта с митохондриальными лизосомами.
Корреляционная световая и электронная микроскопия — это метод визуализации, сочетающий в себе преимущества световой микроскопии и электронной микроскопии. В этом протоколе мы максимально используем преимущества CLEM, используя двухцветные зонды для визуализации контакта с митохондриальными лизосомами. С помощью традиционных методов отбора проб с помощью электронных микроскопии четко различить деградацию митохондрий в лизосомах сложно.
В этом исследовании представлен результат CLEM с высоким разрешением, который ясно показал эффекторный домен лизосом и митохондрий. Метод двухцветного забора был использован для точного различения эффекторов митохондрий в лизосомах. Наше исследование показало, что митохондрии взаимодействуют с лизосомами.
Наше исследование показало, что митохондрии по-разному взаимодействуют с лизосомами в ответ на различные внешние стрессы. Изучая причины и регуляторы этих явлений, мы получим представление о понимании внутриклеточного контроля качества митохондрий. Для начала культивируют клетки HeLa с плотностью один умножить на 10 в степени пяти в 35-миллиметровые стеклянные чашки с сетчатым дном.
На следующий день проводят совместную трансфекцию клеток с конфлюенцией от 30% до 40% с плазмидами с помощью реагента для трансфекции. После трансфекции обрабатывайте клетки диметилсульфоксидом или U18666A и бафиломицином А1 в течение 18 часов. Для конфокальной визуализации удалите питательные среды и немедленно добавьте 250 микролитров теплого фиксирующего раствора при температуре от 30 до 37 градусов Цельсия.
Немедленно снимите фиксатор. Замените его 1,5 миллилитрами свежего фиксатора и выдержите на льду в течение 30 минут. Затем промойте клетки три раза по 10 минут каждая одним миллилитром ледяного 0,1 молярного буфера какодилата натрия.
Далее добавьте один миллилитр холодного 20-миллимолярного раствора глицина для гашения альдегида. После инкубации клеток на льду в течение 10 минут промойте их трижды по 10 минут каждый в холодном 0,1 молярном буфере какодилата натрия. Затем добавьте в чашку для образца 500 микролитров красного раствора Amplex и выдержите пять минут на льду.
После этого удалите красный раствор Amplex и промойте клетки три раза в течение 10 минут каждый с 0,1 молярного буфера какодилата натрия. Используйте конфокальный микроскоп для визуализации области вокруг интересующих клеток в режиме сканирования плиток три на три. Захват как дифференциальных, интерференционных, контрастных, так и флуоресцентных сигналов для идентификации и записи сетки и букв на сетчатой тарелке с помощью объектива с 40-кратным увеличением.
Визуализируйте целевые клетки с большим увеличением с помощью 40-кратного объектива и получите Z-стековое изображение. После визуализации окрашенных в красный цвет клеток Amplex с помощью конфокального микроскопа добавьте один миллилитр 1% восстановленного тетраоксида осмия при четырех градусах Цельсия и инкубируйте в течение одного часа. Затем промойте образец три раза по 10 минут каждый дистиллированной водой при температуре четыре градуса Цельсия.
Обезвоживайте в сортированном этаноле в течение 15 минут каждый раз при комнатной температуре. Теперь смешайте этанол с эпоксидной смолой в объемном соотношении три к одному, один к одному и один к трем, приготовив в общей сложности по 300 микролитров каждой смеси. Вылейте каждую смесь эпоксидной смолы в посуду и выдерживайте при комнатной температуре в течение часа.
Далее приготовьте закладную капсулу, заполнив ее свежей эпоксидной смолой. Переверните пробирку или капсулу вверх дном в интересующей области и поместите ее в духовку при температуре 60 градусов Цельсия на 48 часов для полимеризации. Затем погрузите нижнее стекло и полимерный блок в жидкий азот, чтобы разделить их.
Поместите блок образцов в держатель образца ультра-микротома и установите его в обрезной блок. С помощью лезвия бритвы обрежьте смолу в прямоугольную или трапециевидную форму вокруг интересующего объекта. Поместите обрезанный блок образцов в держатель образца и отрегулируйте алмазное лезвие.
Используя ультра-микротом, вырежьте ультратонкие срезы примерно на 60-70 нанометров от плоских встроенных ячеек. Соберите серийные секции на щелевой сетке с формварным покрытием, прежде чем высушить их на горячей плите. После этого окрашивайте участки контрастным веществом в течение двух минут и цитратом свинца в течение одной минуты.
Затем поместите сетку в просвечивающий электронный микроскоп, или ПЭМ, держатель образца для наблюдения. На основе дифференциально-интерференционно-контрастного изображения, полученного с помощью светового микроскопа, определите интересующую клетку-мишень и получите изображение всей клеточной клетки с использованием плиточного перекрытия изображений с увеличением в 1 700 раз Чтобы получить коррелятивные световые и электронные микроскопические изображения клеток HeLa с помощью ImageJ Fiji, запустите ImageJ Fiji и нажмите на файл, новый, TrakEM2 blank, и выберите папку хранения для создания нового проекта TrakEM2. Перетащите необработанные данные изображения фрагмента в рабочую область, чтобы открыть набор данных изображений фрагментов.
Кликаем правой кнопкой мыши и выделяем линию, монтируем все изображения в этом слое и упругие нелинейные блочные соответствия. Затем нажмите кнопку ОК, чтобы принять значения по умолчанию для остальных параметров. Затем нажмите правую кнопку мыши и выберите экспорт, а затем создайте плоское изображение, чтобы создать сшитое изображение.
Затем нажмите «Файл» и «Сохранить», чтобы сохранить изображение. Чтобы изменить размер флуоресцентного изображения, откройте программу для увеличения фотографий. Нажмите на файл, откройте и выберите изображение.
Введите ширину и высоту. Чтобы соответствовать размеру изображения с помощью электронного микроскопа. Выберите алгоритм, который будет применяться в методе resize.
Нажмите на файл и сохраните, чтобы сохранить измененное изображение. Откройте ImageJ Fiji и перетащите флуоресценцию с измененным размером и сшитую электронную микрофотографию в рабочую область. Нажмите на плагины просмотра больших данных и большой деформации, чтобы начать регистрацию.
Затем нажмите на выпадающее меню, чтобы выбрать изображение флуоресцентной микрофотографии в качестве движущегося изображения и изображение электронной микрофотографии в качестве целевого изображения. Используя такие функции, как масштабирование, поворот изображения и перемещение, сравнивайте флуоресцентные и электронные микрографические изображения. Нажмите клавишу пробела на клавиатуре, чтобы переключиться в режим ориентиров, и нажмите левую кнопку мыши, чтобы отметить как минимум три ориентира, обозначенных на обоих изображениях.
Отметив все выявленные ориентиры, перейдите в файл, экспортируйте движущееся изображение и нажмите OK. Появится новое всплывающее окно с преобразованным изображением флуоресцентной микрофотографии. Нажмите на файл и сохраните как преобразованное изображение флуоресцентной микрофотографии.
Чтобы наложить изображения CLEM, перетащите преобразованное изображение флуоресцентной микрофотографии и сшитое изображение электронной микрофотографии в рабочую область ImageJ. Нажмите на изображение, тип и восьмибитный цвет. Установка одного и того же типа изображения для флуоресцентного и электронного микрографического изображений.
Нажмите на изображение, цвет и объедините каналы. Чтобы объединить изображения. Нажмите на файл и сохраните как сохранить изображение CREM.
Митохондрии, захваченные в лизосомах, наблюдались в клетках, обработанных бафиломицином А1, что указывает на ингибирование аутофагии и снижение качества митохондрий, в то время как контрольные клетки показали, что митохондрии взаимодействуют с лизосомами, но не поглощаются ими, митохондриальное нарушение, наблюдаемое в контрольных клетках, показало, что митохондрии окружают лизосомы, а не поглощаются ими. Клетки, обработанные U18666A, показали повышенное взаимодействие между митохондриями и лизосомами, при этом некоторые лизосомы были поглощены митохондриями.
