La disfunción mitocondrial se asocia con muchas enfermedades, en particular trastornos neurodegenerativos y metabólicos. Por lo tanto, si podemos entender cómo las mitocondrias son reguladas por los lisosomas, ayuda a desarrollar nuevas estrategias terapéuticas. En este protocolo, demostramos un método CLEM de doble color para visualizar el contacto del lisosoma mitocondrial.
La microscopía óptica y electrónica correlativa es una técnica de imagen que combina las ventajas de la microscopía óptica y la microscopía electrónica. En este protocolo, maximizamos la ventaja de CLEM utilizando sondas de doble color para visualizar el contacto del lisosoma mitocondrial. Es difícil distinguir claramente la degradación de las mitocondrias dentro de los lisosomas utilizando los métodos tradicionales de muestreo de microscopía electrónica.
Este estudio presenta resultados de CLEM de alta resolución que mostraron claramente el dominio efector de lisosomas y mitocondrias. Se utilizó el método de toma de doble color para distinguir con precisión los efectores de las mitocondrias dentro de los lisosomas. Nuestra investigación ha revelado que las mitocondrias interactúan con los lisosomas.
Nuestra investigación ha revelado que las mitocondrias interactuaron con los lisosomas de diferentes maneras en respuesta a diferentes tensiones externas. Al estudiar las causas y los reguladores de estos fenómenos, obtendremos información sobre la comprensión del control de calidad mitocondrial intracelular. Para empezar, cultive células HeLa a una densidad de uno por 10 elevado a cinco en placas de cultivo con fondo de rejilla de vidrio de 35 milímetros.
Al día siguiente, co-transfecte las células con una confluencia del 30% al 40% con los plásmidos utilizando el reactivo de transfección. Después de la transfección, tratar las células con dimetilsulfóxido o U18666A y bafilomycina A1 durante 18 horas. Para la obtención de imágenes confocal, retire el medio de cultivo y agregue inmediatamente 250 microlitros de solución fijadora tibia a 30 a 37 grados Celsius.
Retire inmediatamente el fijador. Reemplácelo con 1,5 mililitros de fijador fresco e incube en hielo durante 30 minutos. A continuación, lave las células tres veces durante 10 minutos cada una con un mililitro de tampón de cacodilato de sodio 0,1 molar helado.
A continuación, agregue un mililitro de solución fría de glicina de 20 milimolares para apagar el aldehído. Después de incubar las células en hielo durante 10 minutos, lávelas tres veces durante 10 minutos cada una con tampón de cacodilato de sodio frío 0,1 molar. A continuación, añada 500 microlitros de solución roja Amplex a la placa de muestra e incube durante cinco minutos en hielo.
A continuación, retire la solución roja de Amplex y enjuague las células tres veces durante 10 minutos cada una con tampón de cacodilato de sodio 0,1 molar. Utilice un microscopio confocal para obtener imágenes del área alrededor de las celdas de interés en el modo de escaneo de mosaico de tres por tres. Capture tanto el contraste de interferencia diferencial como las señales fluorescentes para identificar y registrar la cuadrícula y las letras en el plato de la cuadrícula utilizando un objetivo de 40 veces.
Obtenga imágenes de las celdas objetivo con un gran aumento utilizando un objetivo de 40 veces y adquiera una imagen de pila Z. Después de obtener imágenes de las células teñidas de rojo Amplex con un microscopio confocal, agregue un mililitro de tetróxido de osmio reducido al 1% a cuatro grados Celsius e incube durante una hora. A continuación, enjuague la muestra tres veces durante 10 minutos cada una con agua destilada a cuatro grados centígrados.
Deshidrate en una serie de etanol graduado durante 15 minutos cada vez a temperatura ambiente. Ahora mezcle etanol con resina epoxi en proporciones de volumen de tres a uno, uno a uno y uno a tres, preparando un total de 300 microlitros de cada mezcla. Vierta cada mezcla de resina epoxi en el plato e incube a temperatura ambiente durante una hora.
A continuación, prepare la cápsula de inclusión llenándola con resina epoxi fresca. Dale la vuelta al tubo o cápsula en la región de interés y colócalo en un horno a 60 grados centígrados durante 48 horas para polimerizar. A continuación, sumerja el vidrio inferior y el bloque de polímero en nitrógeno líquido para separarlos.
Coloque el bloque de muestras en el portamuestras del ultra micrótomo y colóquelo en el bloque de recorte. Usa una cuchilla de afeitar para recortar la resina en forma rectangular o trapezoidal alrededor del objeto de interés. Coloque el bloque de muestras recortado en el portamuestras y ajuste el disco de diamante.
Con un micrótomo ultra, corte secciones ultrafinas de aproximadamente 60 a 70 nanómetros de las células planas incrustadas. Recoja las secciones en serie en una rejilla de ranura recubierta de formvar antes de secarlas en una placa caliente. Después, tiñe las secciones con tinte de contraste durante dos minutos y citrato de plomo durante un minuto.
A continuación, coloque la rejilla en el soporte de muestras del microscopio electrónico de transmisión, o TEM, para su observación. Sobre la base de la imagen de contraste de interferencia diferencial del microscopio óptico, identifique la célula objetivo de interés e obtenga una imagen de toda el área de la célula utilizando imágenes superpuestas en mosaico con un aumento de 1.700 veces Para obtener las imágenes correlativas de microscopía óptica y electrónica de las células HeLa utilizando ImageJ Fiji, inicie ImageJ Fiji y haga clic en archivo, nuevo, TrakEM2 en blanco, y seleccione carpeta de almacenamiento para crear un nuevo proyecto de TrakEM2. Arrastre y suelte los datos de la imagen de tesela sin procesar en el espacio de trabajo para abrir el conjunto de datos de imagen de tesela.
Haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione la línea, monte todas las imágenes de esta capa y las correspondencias elásticas de bloques no lineales. A continuación, haga clic en Aceptar para aceptar los valores predeterminados para los parámetros restantes. A continuación, haga clic con el botón derecho del ratón y seleccione exportar, seguido de crear una imagen plana para crear una imagen unida.
A continuación, haga clic en archivo y guarde como para guardar la imagen. Para cambiar el tamaño de la imagen de fluorescencia, abra el software de ampliación de fotos. Haga clic en archivo, abra y seleccione la imagen.
Introduzca la anchura y la altura. Para que coincida con el tamaño de la imagen del microscopio electrónico. Seleccione el algoritmo que se aplicará en el método de cambio de tamaño.
Haga clic en archivo y guardar como para guardar la imagen redimensionada. Abra ImageJ Fiji y arrastre y suelte la fluorescencia redimensionada y la micrografía electrónica cosida en el espacio de trabajo. Haga clic en los complementos big data viewer y big warp para iniciar el registro.
A continuación, haga clic en el menú desplegable para seleccionar la imagen de la micrografía de fluorescencia como imagen en movimiento y la imagen de la micrografía electrónica como imagen de destino. Utilizando funciones como el zoom, la rotación de la imagen y el movimiento, compare las imágenes de fluorescencia y micrografía electrónica. Pulse la barra espaciadora del teclado para cambiar al modo de hito y pulse el botón izquierdo del ratón para marcar al menos tres puntos de referencia identificados en ambas imágenes.
Después de marcar todos los puntos de referencia identificados, vaya a archivo, exporte imagen en movimiento y haga clic en Aceptar. Aparecerá una nueva ventana emergente con la imagen de micrografía de fluorescencia transformada. Haga clic en archivo y guardar como para guardar la imagen de micrografía de fluorescencia transformada.
Para superponer las imágenes CLEM, arrastre y suelte la imagen de micrografía de fluorescencia transformada y la imagen de micrografía electrónica unida en el espacio de trabajo de ImageJ. Haga clic en la imagen, el tipo y el color de ocho bits. Para establecer el mismo tipo de imagen para las imágenes de fluorescencia y de micrografía electrónica.
Haga clic en la imagen, coloree y combine canales. Para combinar las imágenes. Haga clic en archivo y guardar como para guardar la imagen CLEM.
Las mitocondrias atrapadas dentro de los lisosomas se observaron en las células tratadas con bafilomicina A1, lo que indica una autofagia inhibida y una reducción de la calidad mitocondrial, mientras que las células de control mostraron mitocondrias interactuando con los lisosomas pero no engullidas por ellos, la interrupción mitocondrial observada en las células de control mostró que las mitocondrias rodeaban a los lisosomas en lugar de ser engullidas por ellos. U18666A células tratadas mostraron un aumento de las interacciones entre las mitocondrias y los lisosomas, con algunos lisosomas engullidos por mitocondrias.
