A disfunção mitocondrial está associada a muitas doenças, particularmente distúrbios neurodegenerativos e metabólicos. Portanto, se pudermos entender como as mitocôndrias são reguladas pelos lisossomos, isso ajuda a desenvolver novas estratégias terapêuticas. Neste protocolo, demonstramos um método CLEM de duas cores para visualizar o contato com os lisossomos mitocondriais.
A microscopia de luz e eletrônica correlativa é uma técnica de imagem que combina as vantagens da microscopia de luz e da microscopia eletrônica. Neste protocolo, maximizamos a vantagem do CLEM usando sondas de duas cores para visualizar o contato com os lisossomos mitocondriais. É um desafio distinguir claramente as mitocôndrias que se degradam dentro dos lisossomos usando métodos tradicionais de amostragem por microscopia eletrônica.
Este estudo apresenta resultado CLEM de alta resolução que mostrou claramente o domínio efetor dos lisossomos e mitocôndrias. O método de tomada de duas cores foi usado para distinguir com precisão os efetores das mitocôndrias dentro dos lisossomos. Nossa pesquisa revelou que as mitocôndrias interagem com os lisossomos.
Nossa pesquisa revelou que as mitocôndrias interagiram com os lisossomos de maneiras diferentes em resposta a diferentes estresses externos. Ao estudar as causas e reguladores desses fenômenos, obteremos informações sobre a compreensão do controle de qualidade mitocondrial intracelular. Para começar, cultive células HeLa a uma densidade de um vezes 10 elevado a cinco em placas de cultura de vidro com fundo de grade de 35 milímetros.
No dia seguinte, co-transfectar as células em 30% a 40% de confluência com plasmídeos usando o reagente de transfecção. Após a transfecção, trate as células com dimetilsulfóxido ou U18666A e bafilomicina A1 por 18 horas. Para imagens confocais, remova o meio de cultura e adicione imediatamente 250 microlitros de solução fixadora quente a 30 a 37 graus Celsius.
Remova imediatamente o fixador. Substitua-o por 1,5 mililitros de fixador fresco e incube-o no gelo por 30 minutos. Em seguida, lave as células três vezes por 10 minutos cada com um mililitro de tampão de cacodilato de sódio molar 0,1 molar gelado.
Em seguida, adicione um mililitro de solução fria de glicina 20 milimolar para extinguir o aldeído. Depois de incubar as células no gelo por 10 minutos, lave-as três vezes por 10 minutos cada em tampão de cacodilato de sódio 0,1 molar frio. Em seguida, adicione 500 microlitros de solução vermelha Amplex ao prato de amostra e incube por cinco minutos no gelo.
Em seguida, remova a solução vermelha de Amplex e enxágue as células três vezes por 10 minutos cada com tampão de cacodilato de sódio 0,1 molar. Use um microscópio confocal para obter imagens da área ao redor das células de interesse no modo de varredura de três por três ladrilhos. Capture sinais de contraste de interferência diferencial e fluorescentes para identificar e registrar a grade e as letras na antena parabólica usando uma objetiva de 40 vezes.
Visualize as células-alvo em alta ampliação usando uma objetiva de 40 vezes e adquira uma imagem de pilha Z. Depois de obter imagens das células coradas com vermelho Amplex usando um microscópio confocal, adicione um mililitro de tetróxido de ósmio reduzido a 1% a quatro graus Celsius e incube por uma hora. Em seguida, enxágue a amostra três vezes por 10 minutos cada com água destilada a quatro graus Celsius.
Desidratar em uma série graduada de etanol por 15 minutos de cada vez à temperatura ambiente. Agora misture etanol com resina epóxi em proporções de volume de três para um, um para um e um para três, preparando um total de 300 microlitros de cada mistura. Despeje cada mistura de resina epóxi no prato e incube em temperatura ambiente por uma hora.
Em seguida, prepare a cápsula de incorporação preenchendo-a com resina epóxi nova. Vire o tubo ou cápsula de cabeça para baixo na região de interesse e coloque-o em um forno a 60 graus Celsius por 48 horas para polimerizar. Em seguida, mergulhe o vidro inferior e o bloco de polímero em nitrogênio líquido para separá-los.
Coloque o bloco de amostra no suporte de amostra do ultramicrótomo e coloque-o no bloco de corte. Use uma lâmina de barbear para aparar a resina em uma forma retangular ou trapezoidal ao redor do objeto de interesse. Coloque o bloco de amostra aparado no porta-amostras e ajuste a lâmina diamantada.
Usando um micrótomo ultra, corte seções ultrafinas de aproximadamente 60 a 70 nanômetros das células embutidas planas. Recolha as seções seriais em uma grade de ranhura revestida com formvar antes de secá-las em uma placa quente. Depois, core as seções com contraste por dois minutos e citrato de chumbo por um minuto.
Em seguida, coloque a grade no microscópio eletrônico de transmissão, ou TEM, porta-amostras para observação. Com base na imagem de contraste de interferência diferencial do microscópio óptico, identifique a célula-alvo de interesse e obtenha imagens de toda a área celular usando imagens sobrepostas lado a lado com ampliação de 1.700 vezes Para obter as imagens correlativas de luz e microscopia eletrônica de células HeLa usando ImageJ Fiji, inicie o ImageJ Fiji e clique em arquivo, novo, TrakEM2 em branco, e selecione a pasta de armazenamento para criar um novo projeto TrakEM2. Arraste e solte os dados brutos da imagem do bloco no workspace para abrir o conjunto de dados da imagem do bloco.
Clique com o botão direito do mouse e selecione a linha, monte todas as imagens nesta camada e as correspondências de blocos não lineares elásticos. Em seguida, clique em OK para aceitar os valores padrão para os parâmetros restantes. Em seguida, clique com o botão direito do mouse e selecione exportar, seguido de criar imagem plana para criar uma imagem costurada.
Em seguida, clique em arquivo e salvar como para salvar a imagem. Para redimensionar a imagem de fluorescência, abra o software de ampliação de fotos. Clique em arquivo, abra e selecione a imagem.
Insira a largura e a altura. Para corresponder ao tamanho da imagem do microscópio eletrônico. Selecione o algoritmo a ser aplicado no método de redimensionamento.
Clique no arquivo e salve como para salvar a imagem redimensionada. Abra o ImageJ Fiji e arraste e solte a fluorescência redimensionada e a micrografia eletrônica costurada na área de trabalho. Clique nos plug-ins big data viewer e big warp para iniciar o registro.
Em seguida, clique no menu suspenso para selecionar a imagem da micrografia de fluorescência como a imagem em movimento e a imagem da micrografia eletrônica como a imagem de destino. Usando funções como zoom, rotação da imagem e movimento, compare as imagens de fluorescência e micrografia eletrônica. Pressione a barra de espaço no teclado para alternar para o modo de ponto de referência e pressione o botão esquerdo do mouse para marcar pelo menos três pontos de referência identificados em ambas as imagens.
Depois de marcar todos os pontos de referência identificados, vá para o arquivo, exporte a imagem em movimento e clique em OK. Uma nova janela pop-up com a imagem de micrografia de fluorescência transformada aparecerá. Clique no arquivo e salve como para salvar a imagem da micrografia de fluorescência transformada.
Para sobrepor as imagens CLEM, arraste e solte a imagem de micrografia de fluorescência transformada e a imagem de micrografia de elétrons costurada na área de trabalho do ImageJ. Clique na imagem, tipo e cor de oito bits. Para definir o mesmo tipo de imagem para as imagens de fluorescência e micrografia eletrônica.
Clique em imagem, cor e mesclar canais. Para combinar as imagens. Clique em arquivo e salve como para salvar a imagem CLEM.
As mitocôndrias presas nos lisossomos foram observadas em células tratadas com bafilomicina A1, indicando autofagia inibida e redução da qualidade mitocondrial, enquanto as células de controle mostraram mitocôndrias interagindo, mas não engolfadas por lisossomos, a ruptura mitocondrial observada nas células de controle mostrou que as mitocôndrias cercaram os lisossomos em vez de serem engolidas por eles. U18666A células tratadas mostraram interações aumentadas entre mitocôndrias e lisossomos, com alguns lisossomos engolfados por mitocôndrias.
