תפקוד לקוי של המיטוכונדריה קשור למחלות רבות, במיוחד הפרעות ניווניות ומטבוליות. לכן, אם נוכל להבין כיצד המיטוכונדריה מווסתת על ידי ליזוזומים, זה עוזר לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות. בפרוטוקול זה, הדגמנו שיטת CLEM דו-צבעונית להדמיית מגע ליזוזום מיטוכונדריאלי.
מיקרוסקופ אור ואלקטרונים בקורלציה היא טכניקת הדמיה המשלבת את היתרונות של מיקרוסקופ אור ומיקרוסקופ אלקטרונים. בפרוטוקול זה, אנו ממקסמים את היתרון של CLEM באמצעות בדיקות בצבע כפול כדי להמחיש מגע ליזוזום מיטוכונדריאלי. זה מאתגר להבחין בבירור בין המיטוכונדריה המתפרקת בתוך הליזוזומים באמצעות שיטות דגימה מסורתיות של מיקרוסקופ אלקטרונים.
מחקר זה מציג תוצאת CLEM ברזולוציה גבוהה שהראתה בבירור את תחום ההשפעה של ליזוזומים ומיטוכונדריה. שיטת לקיחת הצבע הכפול שימשה להבחנה מדויקת בין אפקטורים של מיטוכונדריה בתוך ליזוזומים. המחקר שלנו גילה שהמיטוכונדריה מקיימים אינטראקציה עם הליזוזומים.
המחקר שלנו גילה כי מיטוכונדריה קיימה אינטראקציה עם ליזוזומים בדרכים שונות בתגובה ללחצים חיצוניים שונים. על ידי חקר הגורמים והווסתים של תופעות אלה, נקבל תובנה להבנת בקרת איכות המיטוכונדריה התוך תאית. כדי להתחיל, תרבית תאי HeLa בצפיפות של אחת כפול 10 בחזקת חמישה בכלי תרבית עם תחתית רשת זכוכית בגודל 35 מילימטר.
למחרת, העבירו את התאים במפגש של 30% עד 40% עם פלסמידים באמצעות מגיב הטרנספקציה. לאחר הטרנספקציה יש לטפל בתאים עם דימתיל סולפוקסיד או U18666A ובפילומיצין A1 למשך 18 שעות. להדמיה קונפוקלית, הסר את אמצעי התרבות והוסף מיד 250 מיקרוליטר של תמיסת קיבוע חמה בטמפרטורה של 30 עד 37 מעלות צלזיוס.
הסר מיד את הקיבוע. החלף אותו ב -1.5 מיליליטר של קיבוע טרי ודגר אותו על קרח למשך 30 דקות. לאחר מכן שטפו את התאים שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד עם מיליליטר אחד של מאגר נתרן קקודילאט קר כקרח.
לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של תמיסת גליצין קרה של 20 מילי-מולרית כדי להרוות את האלדהיד. לאחר דגירה של התאים על קרח למשך 10 דקות, שטפו אותם שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחד במאגר נתרן קקודילאט קר 0.1 מולרי. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של תמיסה אדומה של אמפלקס לצלחת הדגימה ודגרו במשך חמש דקות על קרח.
לאחר מכן, הסר את התמיסה האדומה של אמפלקס ושטוף את התאים שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחד עם 0.1 מולארי נתרן קקודילאט. השתמש במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לדמות את האזור סביב התאים המעניינים במצב סריקת אריחים של שלושה על שלושה. לכוד גם ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות וגם אותות פלואורסצנטיים כדי לזהות ולתעד את הרשת והאותיות על צלחת הרשת באמצעות מטרה של פי 40.
דמיין את תאי המטרה בהגדלה גבוהה באמצעות מטרה של פי 40 ורכוש תמונת Z-stack. לאחר הדמיית התאים המוכתמים באדום של אמפלקס באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, הוסף מיליליטר אחד של 1% טטרוקסיד אוסמיום מופחת בארבע מעלות צלזיוס ודגירה למשך שעה. לאחר מכן שטפו את הדגימה שלוש פעמים למשך 10 דקות כל אחת במים מזוקקים בארבע מעלות צלזיוס.
התייבשו בסדרת אתנול מדורגת למשך 15 דקות בכל פעם בטמפרטורת החדר. כעת מערבבים אתנול עם שרף אפוקסי ביחסי נפח של שלושה לאחד, אחד לאחד ואחד לשלושה, ומכינים בסך הכל 300 מיקרוליטר מכל תערובת. שופכים כל תערובת שרף אפוקסי לתבשיל ודוגרים בטמפרטורת החדר למשך שעה.
לאחר מכן, הכינו את קפסולת ההטבעה על ידי מילויה בשרף אפוקסי טרי. הפוך את הצינור או הקפסולה באזור העניין והכניס אותו לתנור בחום של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות לפילמור. לאחר מכן טבלו את הזכוכית התחתונה ואת גוש הפולימר בחנקן נוזלי כדי להפריד ביניהם.
הנח את בלוק הדגימה במחזיק הדגימה של המיקרוטום האולטרה והנח אותו בבלוק החיתוך. השתמש בסכין גילוח כדי לקצץ את השרף לצורה מלבנית או טרפזית סביב מושא העניין. הנח את בלוק הדגימה הגזוז במחזיק הדגימה והתאם את להב היהלום.
בעזרת מיקרוטום אולטרה, חותכים קטעים דקים במיוחד כ-60 עד 70 ננומטר מהתאים המשובצים השטוחים. אסוף את החלקים הסדרתיים על רשת חריצים מצופה formvar לפני ייבושם על פלטה חמה. לאחר מכן, צבעו את החלקים בכתם ניגודיות למשך שתי דקות וציטראט עופרת למשך דקה אחת.
לאחר מכן הנח את הרשת במיקרוסקופ אלקטרוני השידור, או TEM, מחזיק דגימה לתצפית. בהתבסס על תמונת ניגודיות ההפרעות הדיפרנציאליות ממיקרוסקופ האור, זהה את תא המטרה המעניין ודמיין את כל שטח התא באמצעות תמונות חופפות אריחים בהגדלה של פי 1, 700 כדי להשיג את תמונות האור והמיקרוסקופ האלקטרונים המתאם של תאי HeLa באמצעות ImageJ Fiji, הפעל את ImageJ Fiji ולחץ על קובץ, חדש, TrakEM2 ריק, ובחר תיקיית אחסון כדי ליצור פרויקט TrakEM2 חדש. גרור ושחרר את נתוני תמונת האריח הגולמי לסביבת העבודה כדי לפתוח את ערכת הנתונים של תמונת האריח.
לחץ על כפתור העכבר הימני ובחר את הקו, מונטאז' את כל התמונות בשכבה זו והתכתבויות בלוק אלסטיות לא ליניאריות. לאחר מכן לחץ על אישור כדי לקבל את ערכי ברירת המחדל עבור הפרמטרים הנותרים. לאחר מכן, לחץ על לחצן העכבר הימני ובחר ייצוא, ואחריו צור תמונה שטוחה ליצירת תמונה תפורה.
לאחר מכן לחץ על קובץ ושמור בשם כדי לשמור את התמונה. כדי לשנות את גודל תמונת הקרינה, פתח את תוכנת הגדלת התמונות. לחץ על קובץ, פתח ובחר את התמונה.
הזן את הרוחב והגובה. כדי להתאים לגודל תמונת מיקרוסקופ האלקטרונים. בחר את האלגוריתם שיוחל בשיטת שינוי הגודל.
לחץ על קובץ ושמור בשם כדי לשמור את התמונה שגודלה השתנה. פתח את ImageJ Fiji וגרור ושחרר את הקרינה שגודלה השתנה ואת מיקרוגרף האלקטרונים התפור לתוך סביבת העבודה. לחץ על התוספים מציג ביג דאטה ועיוות גדול כדי להתחיל את הרישום.
לאחר מכן לחץ על התפריט הנפתח כדי לבחור את תמונת המיקרוגרף הקרינה כתמונה הנעה ואת תמונת המיקרוגרף האלקטרוני כתמונת היעד. באמצעות פונקציות כגון זום, סיבוב תמונה ותנועה, השווה את תמונות הקרינה והמיקרוגרף האלקטרוני. לחץ על מקש הרווח במקלדת כדי לעבור למצב ציון דרך ולחץ על לחצן העכבר השמאלי כדי לסמן לפחות שלושה ציוני דרך שזוהו בשתי התמונות.
לאחר סימון כל ציוני הדרך שזוהו, עבור לקובץ, ייצא תמונה נעה ולחץ על אישור. יופיע חלון מוקפץ חדש עם תמונת המיקרוגרף הקרינה שהשתנתה. לחץ על קובץ ושמור בשם כדי לשמור את תמונת המיקרוגרף הקרינה שהשתנתה.
כדי לכסות את תמונות CLEM, גרור ושחרר את תמונת המיקרוגרף הקרינה שהשתנתה ואת תמונת המיקרוגרף האלקטרוני התפור לסביבת העבודה של ImageJ. לחץ על תמונה, סוג וצבע של שמונה סיביות. כדי להגדיר את אותו סוג תמונה הן עבור תמונות הקרינה והן עבור תמונות מיקרוגרף אלקטרונים.
לחץ על תמונה, צבע ומיזוג ערוצים. כדי לשלב את התמונות. לחץ על קובץ ושמור בשם כדי לשמור את תמונת ה-CLEM.
מיטוכונדריה שנלכדה בתוך ליזוזומים נצפו בתאים שטופלו בבפילומיצין A1 המצביעים על אוטופגיה מעוכבת וירידה באיכות המיטוכונדריה, בעוד שתאי בקרה הראו אינטראקציה של מיטוכונדריה עם ליזוזומים אך לא נבלעים על ידם, ההפרעה המיטוכונדריאלית שנצפתה בתאי הבקרה הראתה שהמיטוכונדריה הקיפה את הליזוזומים במקום להיבלע על ידם. תאים שטופלו U18666A הראו אינטראקציות מוגברות בין מיטוכונדריה לליזוזומים, כאשר חלק מהליזוזומים נבלעים על ידי מיטוכונדריה.
