ミトコンドリアの機能障害は、多くの疾患、特に神経変性疾患や代謝障害と関連しています。したがって、ミトコンドリアがリソソームによってどのように制御されているかを理解することができれば、新しい治療戦略の開発に役立ちます。このプロトコルでは、ミトコンドリアのリソソーム接触を視覚化するためのデュアルカラーCLEM法を実証しました。
相関光顕微鏡と電子顕微鏡は、光学顕微鏡と電子顕微鏡の利点を組み合わせたイメージング技術です。このプロトコルでは、2色プローブを使用してミトコンドリアリソソームの接触を視覚化するCLEMの利点を最大限に活用します。従来の電子顕微鏡サンプリング法を使用して、リソソーム内で分解するミトコンドリアを明確に区別することは困難です。
この研究は、リソソームとミトコンドリアのエフェクタードメインを明確に示した高解像度のCLEM結果を示しています。二色採法を用いて、リソソーム内のミトコンドリアエフェクターを正確に鑑別しました。私たちの研究により、ミトコンドリアはリソソームと相互作用することが明らかになりました。
私たちの研究により、ミトコンドリアはさまざまな外部ストレスに応答してリソソームと異なる方法で相互作用することが明らかになりました。これらの現象の原因と制御因子を研究することで、細胞内のミトコンドリアの品質管理を理解するための洞察を得ることができます。まず、35mmガラス格子底の培養皿でHeLa細胞を1×10の5乗の密度で培養します。
翌日、トランスフェクション試薬を使用して、プラスミドと30%から40%のコンフルエントで細胞を共トランスフェクションします。トランスフェクション後、細胞をジメチルスルホキシドまたはU18666AおよびバフィロマイシンA1で18時間処理します。共焦点イメージングの場合は、培地を取り出し、すぐに250マイクロリットルの温かい固定液を摂氏30〜37度で加えます。
すぐに固定剤を取り除きます。それを1.5ミリリットルの新鮮な固定剤と交換し、氷上で30分間インキュベートします。次に、細胞を1ミリリットルの氷冷した0.1モルカコジル酸ナトリウム緩衝液でそれぞれ10分間3回洗浄します。
次に、アルデヒドを急冷するために1ミリリットルの冷たい20ミリモルグリシン溶液を追加します。細胞を氷上で10分間インキュベートした後、冷たい0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液でそれぞれ10分間、3回洗浄します。次に、500マイクロリットルのAmplex red溶液をサンプルディッシュに加え、氷上で5分間インキュベートします。
その後、Amplex red溶液を取り出し、0.1モルのカコジル酸ナトリウム緩衝液で細胞をそれぞれ10分間3回すすぎます。共焦点顕微鏡を使用して、目的の細胞の周囲を3×3のタイルスキャンモードでイメージングします。微分干渉コントラストと蛍光信号の両方を捕捉し、40倍対物レンズを使用してグリッドディッシュ上のグリッドと文字を識別して記録します。
40倍対物レンズを用いて標的細胞を高倍率でイメージングし、Zスタック画像を取得します。共焦点顕微鏡を使用してAmplex赤く染色した細胞をイメージングした後、1%還元された四酸化オスミウムを摂氏4度で1ミリリットル加え、1時間インキュベートします。次に、サンプルを摂氏4度の蒸留水でそれぞれ10分間3回すすぎます。
段階的なエタノールシリーズで、室温で毎回15分間脱水します。次に、エタノールとエポキシ樹脂を3対1、1対1、および1対3の体積比で混合し、各混合物の合計300マイクロリットルを準備します。各エポキシ樹脂混合物を皿に注ぎ、室温で1時間インキュベートします。
次に、埋め込みカプセルに新しいエポキシ樹脂を充填して準備します。チューブまたはカプセルを関心領域で逆さまにし、摂氏60度のオーブンに48時間置いて重合します。次に、底面のガラスとポリマーブロックを液体窒素に浸して分離します。
試料ブロックをウルトラミクロトームのサンプルホルダーにセットし、トリミングブロックにセットします。カミソリの刃を使って、対象物の周囲にレジンを長方形または台形にトリミングします。トリミングした試料ブロックをサンプルホルダーに置き、ダイヤモンドブレードを調整します。
ウルトラミクロトームを用いて、平坦な埋め込み細胞から約60〜70ナノメートルの極薄切片を切断します。シリアルセクションをフォームバーコーティングされたスロットグリッドに集めてから、ホットプレートで乾燥させます。その後、切片を造影剤で2分間染色し、クエン酸鉛で1分間染色します。
次に、グリッドを透過型電子顕微鏡(TEM)のサンプルホルダーに入れて観察します。光学顕微鏡からの微分干渉コントラスト画像に基づいて、目的のターゲット細胞を特定し、1、700倍の倍率でタイル張りの重なり合う画像を使用して細胞領域全体を画像化しますImageJフィジーを使用してHeLa細胞の相関光および電子顕微鏡画像を取得するには、ImageJフィジーを起動し、ファイル、新しい、TrakEM2ブランク、をクリックします。 をクリックし、ストレージフォルダを選択して新しいTrakEM2プロジェクトを作成します。未加工のタイル画像データをワークスペースにドラッグ アンド ドロップして、タイル画像データセットを開きます。
マウスの右ボタンをクリックして、線を選択し、このレイヤー内のすべての画像をモンタージュし、弾性非線形ブロック対応を選択します。次に、[OK] をクリックして、残りのパラメーターのデフォルト値を受け入れます。次に、マウスの右ボタンをクリックしてエクスポートを選択し、続いてフラット画像を作成してステッチ画像を作成します。
次に、[ファイル]と[名前を付けて保存]をクリックして画像を保存します。蛍光画像のサイズを変更するには、写真拡大ソフトウェアを開きます。ファイルをクリックし、画像を開いて選択します。
幅と高さを入力します。電子顕微鏡の画像サイズに合わせるため。サイズ変更方法に適用するアルゴリズムを選択します。
[ファイル]をクリックして名前を付けて保存し、サイズ変更された画像を保存します。ImageJ Fijiを開き、サイズ変更した蛍光とステッチした電子顕微鏡写真をワークスペースにドラッグアンドドロップします。プラグイン、ビッグデータビューア、ビッグワープをクリックして登録を開始します。
次に、ドロップダウンメニューをクリックして、動画像として蛍光顕微鏡画像を選択し、ターゲット画像として電子顕微鏡画像を選択します。ズーム、画像回転、移動などの機能を使用して、蛍光顕微鏡画像と電子顕微鏡画像を比較します。キーボードのスペースバーを押してランドマークモードに切り替え、マウスの左ボタンを押して、両方の画像で識別された少なくとも3つのランドマークをマークします。
識別されたすべてのランドマークをマークしたら、ファイルに移動し、動画をエクスポートして、[OK]をクリックします。変換された蛍光顕微鏡写真画像を含む新しいポップアップウィンドウが表示されます。ファイルをクリックして名前を付けて保存し、変換された蛍光顕微鏡写真画像を保存します。
CLEM画像を重ね合わせるには、変換された蛍光顕微鏡画像とステッチされた電子顕微鏡画像をドラッグアンドドロップします。画像、タイプ、8ビットカラーをクリックします。蛍光顕微鏡画像と電子顕微鏡画像の両方に同じ画像タイプを設定します。
画像、色、およびチャネルのマージをクリックします。画像を結合します。「ファイル」をクリックし、「名前を付けて保存」をクリックして、CLEM画像を保存します。
バフィロマイシンA1処理細胞では、リソソーム内に閉じ込められたミトコンドリアが観察され、オートファジーの抑制とミトコンドリアの品質低下が示され、対照細胞ではミトコンドリアがリソソームと相互作用するが、リソソームに飲み込まれていないことが示され、対照細胞で観察されたミトコンドリアの破壊は、ミトコンドリアがリソソームに飲み込まれるのではなく、リソソームを取り囲むことを示しました。U18666A処理した細胞は、ミトコンドリアとリソソームとの間の相互作用の増加を示し、一部のリソソームはミトコンドリアに飲み込まれました。
