لقد طورنا طريقة كروماتوغرافية سريعة تفصل مكونات تفاعل IVT ، ويمكن استخدامها لمراقبة استهلاك NTP وإنتاج mRNA. باستخدام هذه الطريقة ، يمكننا تحسين تفاعل IVT ، وزيادة إنتاجية mRNA مع تقليل تكوين شوائب العملية وتكلفة التفاعل. كانت منهجيتنا رائدة في مجال mRNA ، حيث توضح كيف يمكن أن يؤدي اقتران البيانات التحليلية لتفاعل IVT إلى زيادة الغلة وانخفاض التكاليف.
يستكشف المجال الآن أدوات تحليلية أخرى للعمليات المضمنة ، مثل التحليل الطيفي رامان ، لكن الكروماتوغرافيا لا تزال تحتفظ بمكانة محورية بسبب قدرتها على الحل وسرعتها العالية. أظهرنا كيفية التقاط أدوات تحليلية عالية الإنتاجية مع تصميم برنامج تجريبي لإجراء تحسين شامل لتفاعل IVT. أدى ذلك إلى أعلى عائد تم الإبلاغ عنه من تفاعل IVT يبلغ 25 جراما لكل لتر.
تسمح طريقتنا بمراقبة تركيزات كل من mRNA و NTP في وقت واحد مع أوقات قراءة قصيرة ، وبالتالي فهي مناسبة لمراقبة IVT في الوقت الفعلي تقريبا. يتجه مجال mRNA الآن نحو التصنيع المستمر ل mRNA ، ونحن بالطبع نطور أدوات الجيل التالي لدعم هذا التحول. للبدء ، قم بإذابة وتسخين جميع الكواشف ، باستثناء الإنزيمات ، عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة في كتلة حرارية مضبوطة على 300 دورة في الدقيقة.
ضع علامة على كل أنبوب بنسخ محدد في المختبر أو رقم IVT ونقطة زمنية. أثناء ذوبان الكواشف ، قم بإدخال ماصة ميكرولترين من 100 ملليمولار EDTA في أنابيب معقمة سعة 0.5 ملليلتر. الآن قم بإزالة الإنزيمات من الثلاجة وتخزينها مؤقتا في مبرد.
قم بإعداد 50 إلى 100 ميكرولتر من مزيج التفاعل بكميات مناسبة من كواشف IVT. أضف بوليميراز الحمض النووي الريبي T7 ككاشف أخير عند خلط جميع كواشف IVT. قم بإزالة ميكرولترين من خليط IVT على الفور وقم بتثبيته في أنابيب 0.5 ملليلتر معدة مسبقا تحتوي على اثنين من الميكرولتر EDTA.
ضع أنابيب التفاعل التي تحتوي على مخاليط IVT في الكتلة الحرارية واحتضانها عند 37 درجة مئوية. في كل نقطة زمنية مرغوبة، قم بإزالة ميكرولترين من عينة IVT من خليط التفاعل والماصة في أنابيب تحتوي على EDTA. بعد أن يؤكد التحليل الكروماتوغرافي الاستنفاد الكامل ل NTPs ، قم بإخماد تفاعلات IVT السائبة مع EDTA إلى تركيز نهائي يبلغ 50 ملليمول.
بالنسبة لتفاعل IVT الدفعة الفيدرالية ، امزج مخزونات كل NTP وكلوريد المغنيسيوم. بعد إعداد التفاعل ، عندما ينخفض تركيز NTP إلى أقل من 10٪ ، أضف حجما مناسبا من التغذية إلى تفاعل IVT السائب. بمجرد تحقيق إنتاج mRNA المطلوب ، قم بتعطيل التفاعل بأكمله مع EDTA إلى تركيز نهائي يبلغ 50 ملليمول.
لتكييف العمود ، قم بموازنة عمود تحليلي سعة 0.1 مل في درجة حرارة الغرفة لمدة 12 ساعة قبل التحليل. قم بإرفاق العمود بالنظام الكروماتوغرافي ، باتباع الاتجاه الموضح على مبيت العمود. ثم اغسل العمود ب 50 حجما من الماء المقطر المزدوج متبوعا ب 50 مجلدا من المحالميات البحرية بمعدل تدفق واحد مليلتر في الدقيقة.
بعد ذلك ، قم بتشغيل ثلاث عينات فارغة على الأقل لحقن MPA فقط قبل التحليل لإنشاء خط الأساس. انتقل الآن إلى تحليل عينة اختبار ملاءمة النظام وعينات منحنى المعايرة. لاختبار ملاءمة النظام ، اجمع بين كاشف السد NTPs وقالب البلازميد DNA و mRNA.
الآن قم بإنشاء معيار المعايرة باستخدام عينة mRNA المنقاة المخففة ذات التركيز المعروف مع المرحلة المتنقلة A.إذا لزم الأمر ، قم بإنشاء معايير بتركيزات NTP النهائية تبلغ 0.5 ، واثنين ، وخمسة ، و 10 ، و 15 ، و 20 ميكرومولار لتوليد منحنى المعايرة لجميع NTPs. حدد الحد الأدنى من التخفيف المطلوب لعينات IVT باستخدام الصيغة. قبل التخفيف للتحليل الكروماتوغرافي ، قم بتدوير الدوامة وتدوير عينة IVT المروية.
الماصة MPA وكلوريد الصوديوم في قارورة زجاجية مخروطية الشكل ، ثم أضف عينة IVT المروية. قم بتدوير العينة المحضرة وتحميلها في جهاز أخذ العينات الآلي ، عند أربع درجات مئوية. حقن 25 ميكرولترا من العينة المخففة على العمود التحليلي وقم بقياس الامتصاص عند 260 و 280 نانومتر لكل عينة IVT.
بعد الانتهاء من تحليل جميع عينات IVT ، قم بحقن معيار اختبار ملاءمة النظام مرة أخرى لتأكيد استقرار النظام. تسمح التحليلات السريعة عبر الإنترنت بمراقبة إنتاج الرنا المرسال بمرور الوقت. في هذه التجربة ، قارنا تأثير تكوين المخزن المؤقت IVT على حركية IVT.
IVT الذي يتم إجراؤه باستخدام المخزن المؤقت A نتج عنه أعلى معدل لإنتاج mRNA ، يليه المخزن المؤقت B وتفاعل C.IVT المخزن المؤقت يمكن أيضا إجراؤه كدفعة فيدرالية. تسمح مراقبة استهلاك NTPs بضبط التركيز عن طريق تغذية NTPs وكلوريد المغنيسيوم للتفاعل. نظرا لأن إضافات التغذية تخفف تفاعل IVT ، فإن تركيز الرنا المرسال في IVT ينخفض في كل إصدار من طبعات التغذية.
