私たちは、IVT反応成分を分離する迅速なクロマトグラフィー法を開発し、NTP消費量とmRNA産生のモニタリングに使用することができます。この方法により、IVT反応を最適化し、mRNAの収量を最大化すると同時に、プロセス不純物の形成と反応のコストを最小限に抑えることができます。私たちの方法論はmRNAの分野で先駆的であり、IVT反応の分析データを結合することで、より高い収量とより低いコストにつながることを示しました。
この分野では現在、ラマン分光法などの他のインラインプロセス分析ツールが模索されていますが、クロマトグラフィーはその分離能と高速性により、依然として重要な位置を占めています。IVT反応を包括的に最適化するための実験ソフトウェア設計とともに、ハイスループット分析ツールを捕捉する方法を示しました。これにより、IVT反応の報告されたすべての収率は25グラム/リットルと最高になりました。
私たちの方法は、mRNAとNTPの両方の濃度を同時に短い読み出し時間で監視できるため、ほぼリアルタイムのIVT監視に適しています。mRNA分野では、mRNAの継続的な製造に向けて動いており、もちろん、この移行を支える次世代のツールを開発しています。まず、酵素を除くすべての試薬を、毎分300回転に設定されたサーモブロックで摂氏37度で15分間解凍し、予熱します。
各チューブに、指定されたin vitro転写またはIVT番号と時点をマークします。試薬が解凍されている間に、2マイクロリットルの100ミリモルEDTAを0.5ミリリットルの滅菌チューブにピペットで移します。次に、酵素を冷凍庫から取り出し、クーラーに一時的に保管します。
50〜100マイクロリットルの反応混合物を適量のIVT試薬と調製します。すべてのIVT試薬を混合した場合の最後の試薬としてT7 RNAポリメラーゼを添加します。直ちに2マイクロリットルのIVT混合物を取り出し、2マイクロリットルのEDTAを含む事前に調製した0.5ミリリットルのチューブにピペットで移します。
IVT混合物を含む反応チューブをサーモブロックに入れ、摂氏37度でインキュベートします。各所望の時点で、反応混合物から2マイクロリットルのIVTサンプルを取り出し、EDTAを含むチューブにピペットで移します。クロマトグラフィー分析によりNTPが完全に枯渇したことが確認された後、EDTAによるバルクIVT反応を最終濃度50ミリモルまでクエンチします。
Fed-Batch IVT反応では、各NTPと塩化マグネシウムのストックを混合します。反応を設定した後、NTP濃度が10%を下回ったら、バルクIVT反応に適切な量のフィードを追加します。目的のmRNA産生が達成されたら、EDTAによる反応全体を不活性化し、最終濃度を50ミリモルにします。
カラムコンディショニングでは、0.1 ミリリットルの分析カラムを室温で 12 時間平衡化してから分析します。カラムハウジングに示されている方向に従って、カラムをクロマトグラフィーシステムに接続します。次に、カラム容量 50 カラムの二重蒸留水でカラムをフラッシュし、続いてカラム容量 50 カラムの MPA を 1 分あたり 1 ミリリットルの流量で洗浄します。
次に、分析前にMPAのみを注入する少なくとも3つのブランクサンプルを分析してベースラインを確立します。次に、システム適合性試験サンプルと検量線サンプルの分析に進みます。システム適合性試験では、キャッピング試薬NTP、プラスミドDNAテンプレート、およびmRNAを組み合わせます。
次に、既知の濃度の希釈精製 mRNA サンプルを移動相 A で使用してキャリブレーション標準液を作成します。必要に応じて、すべての NTP の検量線を生成するための最終 NTP 濃度が 0.5、2、5、10、15、20 マイクロモルの標準液を作成します。IVT サンプルに必要な最小希釈を、次の式を使用して決定します。クロマトグラフィー分析のために希釈する前に、急冷したIVTサンプルをボルテックスしてスピンダウンします。
MPAと塩化ナトリウムを円錐形のガラスバイアルにピペットで入れ、急冷したIVTサンプルを加えます。準備したサンプルをボルテックスし、摂氏4度に設定されたオートサンプラーにロードします。希釈したサンプルの25マイクロリットルを分析カラムに注入し、各IVTサンプルの260ナノメートルと280ナノメートルでの吸光度を測定します。
すべてのIVTサンプルの分析が完了したら、システム適合性試験標準を再度注入して、システムの安定性を確認します。高速アットライン分析により、mRNAの産生を経時的に監視することができます。この実験では、IVTバッファーの組成がIVT動態に及ぼす影響を比較しました。
バッファーAでIVTを行ったところ、mRNA産生率が最も高く、続いてバッファーBとバッファーC.IVT反応はFed-Batchとしても実行できます。NTPの消費量を監視することで、NTPと塩化マグネシウムを反応に供給することで濃度を調整することができます。飼料添加物はIVT反応を希釈するため、IVT中のmRNA濃度は飼料版ごとに低下します。
