Wir haben eine schnelle chromatographische Methode entwickelt, die IVT-Reaktionskomponenten trennt und zur Überwachung des NTP-Verbrauchs und der mRNA-Produktion verwendet werden kann. Mit dieser Methode können wir die IVT-Reaktion optimieren, die mRNA-Ausbeute maximieren und gleichzeitig die Bildung von Prozessverunreinigungen und die Kosten der Reaktion minimieren. Unsere Methodik war bahnbrechend auf dem Gebiet der mRNA und zeigte, wie die Kopplung analytischer Daten der IVT-Reaktion zu höheren Ausbeuten und niedrigeren Kosten führen kann.
Das Feld erforscht derzeit andere Werkzeuge der Inline-Prozessanalyse, wie z. B. die Raman-Spektroskopie, aber die Chromatographie nimmt aufgrund ihres Auflösungsvermögens und ihrer hohen Geschwindigkeit immer noch einen zentralen Platz ein. Wir zeigten, wie man Hochdurchsatz-Analysewerkzeuge mit dem Design von Experimentiersoftware erfassen kann, um eine umfassende Optimierung der IVT-Reaktion vorzunehmen. Dies führte zu einer von 25 Gramm pro Liter höchsten Ausbeute an IVT-Reaktion.
Unsere Methode ermöglicht es, sowohl mRNA- als auch NTP-Konzentrationen gleichzeitig mit kurzen Auslesezeiten zu überwachen, und eignet sich daher für ein IVT-Monitoring nahezu in Echtzeit. Der mRNA-Bereich bewegt sich nun in Richtung einer kontinuierlichen Herstellung von mRNA, und wir entwickeln natürlich Werkzeuge der nächsten Generation, um diesen Übergang zu unterstützen. Zu Beginn alle Reagenzien, mit Ausnahme der Enzyme, auftauen und 15 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem Thermoblock mit 300 Umdrehungen pro Minute vorheizen.
Markieren Sie jedes Röhrchen mit einer bestimmten In-vitro-Transkriptions- oder IVT-Nummer und einem Zeitpunkt. Während die Reagenzien auftauen, pipettieren Sie zwei Mikroliter 100 Millimolar EDTA in sterile 0,5-Milliliter-Röhrchen. Entnehmen Sie nun die Enzyme aus dem Gefrierschrank und lagern Sie sie vorübergehend in einem Kühler.
Bereiten Sie 50 bis 100 Mikroliter des Reaktionsgemisches mit entsprechenden Mengen an IVT-Reagenzien vor. Fügen Sie T7 RNA-Polymerase als letztes Reagenz hinzu, wenn alle IVT-Reagenzien gemischt sind. Entfernen Sie sofort zwei Mikroliter der IVT-Mischung und pipettieren Sie sie in zuvor vorbereitete 0,5-Milliliter-Röhrchen mit zwei Mikrolitern EDTA.
Legen Sie die Reaktionsgefäße mit den IVT-Gemischen in den Thermoblock und inkubieren Sie sie bei 37 Grad Celsius. Zu jedem gewünschten Zeitpunkt werden zwei Mikroliter der IVT-Probe aus dem Reaktionsgemisch entnommen und in Röhrchen mit EDTA pipettiert. Nachdem die chromatographische Analyse die vollständige Depletion der NTPs bestätigt hat, werden IVT-Massenreaktionen mit EDTA auf eine Endkonzentration von 50 Millimolar abgeschreckt.
Für die Fed-Batch-IVT-Reaktion mischen Sie die Stämme jedes NTP mit Magnesiumchlorid. Wenn die NTP-Konzentration nach dem Einrichten der Reaktion unter 10 % fällt, fügen Sie der IVT-Massenreaktion ein geeignetes Volumen des Futters hinzu. Sobald die gewünschte mRNA-Produktion erreicht ist, inaktivieren Sie die gesamte Reaktion mit EDTA bis zu einer Endkonzentration von 50 Millimolar.
Für die Konditionierung der Säule ist eine 0,1-Milliliter-Analysesäule vor der Analyse 12 Stunden lang bei Raumtemperatur zu äquilibrieren. Befestigen Sie die Säule an dem chromatographischen System und befolgen Sie dabei die auf dem Säulengehäuse angegebene Richtung. Spülen Sie dann die Säule mit 50 Säulenvolumina doppelt destilliertem Wasser, gefolgt von 50 Säulenvolumina MPA bei einer Durchflussrate von einem Milliliter pro Minute.
Führen Sie dann mindestens drei Leerproben durch, wobei vor der Analyse nur MPA injiziert wird, um die Ausgangsbasis festzulegen. Fahren Sie nun mit der Analyse des Systemeignungstestmusters und der Kalibrierkurvenmuster fort. Kombinieren Sie für den Systemeignungstest die NTPs des Deckelreagenzes, das Plasmid-DNA-Template und die mRNA.
Erstellen Sie nun den Kalibrierstandard unter Verwendung der verdünnten gereinigten mRNA-Probe mit bekannter Konzentration mit mobiler Phase A. Erstellen Sie bei Bedarf Standards mit NTP-Endkonzentrationen von 0,5, zwei, fünf, 10, 15 und 20 Mikromolar zur Erstellung der Kalibrierkurve für alle NTPs. Bestimmen Sie die minimale Verdünnung, die für IVT-Proben erforderlich ist, anhand der Formel. Vor der Verdünnung für die chromatographische Analyse die abgeschreckte IVT-Probe vortexen und herunterschleudern.
Pipettieren Sie MPA und Natriumchlorid in ein konisches Glasfläschchen und fügen Sie dann die abgeschreckte IVT-Probe hinzu. Die vorbereitete Probe wird mit einem Vortexen versehen und in den Autosampler mit einer Temperatur von vier Grad Celsius geladen. Injizieren Sie 25 Mikroliter der verdünnten Probe auf die analytische Säule und messen Sie die Extinktion bei 260 und 280 Nanometern für jede IVT-Probe.
Nachdem Sie die Analyse aller IVT-Proben abgeschlossen haben, injizieren Sie den Systemeignungsteststandard erneut, um die Systemstabilität zu bestätigen. Die schnelle At-Line-Analytik ermöglicht es, die Produktion von mRNA im Laufe der Zeit zu überwachen. In diesem Experiment haben wir den Einfluss der Zusammensetzung des IVT-Puffers auf die IVT-Kinetik verglichen.
Die IVT, die mit Puffer A durchgeführt wurde, führte zu der höchsten mRNA-Produktionsrate, gefolgt von Puffer B und Puffer C. Die IVT-Reaktion kann auch als Fed-Batch durchgeführt werden. Die Überwachung des Verbrauchs von NTPs ermöglicht es, die Konzentration durch Zuführung von NTPs und Magnesiumchlorid in die Reaktion einzustellen. Da Futterzugaben die IVT-Reaktion verdünnen, sinkt die mRNA-Konzentration in IVT bei jeder Fütterungsausgabe.
