Мы разработали метод быстрой хроматографии, который разделяет компоненты реакции IVT и может быть использован для мониторинга потребления NTP и производства мРНК. С помощью этого метода мы можем оптимизировать реакцию IVT, максимизировать выход мРНК при минимизации образования технологических примесей и стоимости реакции. Наша методология была новаторской в области мРНК, показывающей, как объединение аналитических данных реакции IVT может привести к более высокому выходу и снижению затрат.
В настоящее время в этой области изучаются другие встроенные аналитические инструменты, такие как рамановская спектроскопия, но хроматография по-прежнему занимает центральное место благодаря своей разрешающей способности и высокой скорости. Мы показали, как использовать высокопроизводительные аналитические инструменты с помощью экспериментального программного обеспечения для комплексной оптимизации реакции IVT. Это привело к тому, что каждый зарегистрированный выход реакции IVT составлял 25 граммов на литр.
Наш метод позволяет контролировать концентрации мРНК и НТФ одновременно с коротким временем считывания, поэтому подходит для мониторинга ИВТ в режиме, близком к реальному времени. В настоящее время область мРНК движется в сторону продолжения производства мРНК, и мы, конечно, разрабатываем инструменты следующего поколения для поддержки этого перехода. Для начала разморозьте и разогрейте все реагенты, кроме ферментов, при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут в термоблоке, установленном со скоростью 300 оборотов в минуту.
Пометьте каждую пробирку обозначенным номером и временной точкой транскрипции in vitro или IVT. Пока реагенты размораживаются, пипеткой введите два микролитра 100 миллимолярной ЭДТА в 0,5 миллилитровые стерильные пробирки. Теперь достаньте ферменты из морозилки и временно храните их в холодильнике.
Приготовьте от 50 до 100 микролитров реакционной смеси с соответствующими объемами реагентов IVT. Добавляйте Т7 РНК-полимеразу в качестве последнего реагента при смешивании всех реагентов IVT. Немедленно извлеките два микролитра смеси ИВТ и введите ее пипеткой в заранее подготовленные пробирки объемом 0,5 миллилитров, содержащие два микролитра ЭДТА.
Поместите реакционные пробирки, содержащие смеси IVT, в термоблок и инкубируйте их при температуре 37 градусов Цельсия. В каждый желаемый момент времени извлекайте два микролитра образца IVT из реакционной смеси и пипетируйте в пробирки, содержащие ЭДТА. После того как хроматографический анализ подтвердит полное истощение НТП, погасить объемные реакции ИВТ с ЭДТА до конечной концентрации 50 миллимоляров.
Для реакции Fed-Batch IVT смешайте запасы каждого NTP и хлорида магния. После настройки реакции, когда концентрация NTP упадет ниже 10%, добавьте соответствующий объем сырья в реакцию объемного IVT. Как только желаемое производство мРНК будет достигнуто, инактивируйте всю реакцию с помощью ЭДТА до конечной концентрации 50 миллимоляров.
Для кондиционирования колонки уравновесьте аналитическую колонку объемом 0,1 миллилитра при комнатной температуре в течение 12 часов перед анализом. Прикрепите колонку к хроматографической системе, следуя указанию, указанному на корпусе колонки. Затем промойте колонну 50 колонными объемами двойной дистиллированной воды, а затем 50 колонными объемами МПА со скоростью потока один миллилитр в минуту.
Затем запустите не менее трех пустых образцов, вводя только MPA перед анализом, чтобы установить базовый уровень. Теперь перейдем к анализу образца для проверки пригодности системы и образцов калибровочной кривой. Для теста на пригодность системы объедините реагент NTP, плазмидную матрицу ДНК и мРНК.
Теперь создайте калибровочный стандарт с использованием разбавленного очищенного образца мРНК известной концентрации с подвижной фазой А. При необходимости создайте стандарты с конечными концентрациями NTP 0,5, два, пять, 10, 15 и 20 микромоляров для построения калибровочной кривой для всех NTP. Определите минимальное разведение, необходимое для образцов IVT, используя формулу. Перед разбавлением для хроматографического анализа затушевый образец IVT делают вихревой и закручивают вниз.
Пипетируйте МПА и хлорид натрия в конический стеклянный флакон, затем добавьте закаленный образец ИВТ. Сделайте заворот подготовленного образца и загрузите его в автосамплер, установленный на четыре градуса Цельсия. Введите 25 микролитров разведенного образца в аналитическую колонку и измерьте поглощение на 260 и 280 нанометрах для каждого образца IVT.
После завершения анализа всех образцов IVT повторно введите стандарт теста на пригодность системы, чтобы подтвердить стабильность системы. Быстрая оперативная аналитика позволяет отслеживать выработку мРНК с течением времени. В этом эксперименте мы сравнили влияние состава буфера IVT на кинетику IVT.
IVT, проводимый с буфером A, приводит к наибольшей скорости производства мРНК, за которым следует буфер B и реакция буфера C.IVT, также может быть выполнена в виде Fed-Batch. Контроль расхода НТП позволяет корректировать концентрацию, подавая в реакцию НТП и хлорид магния. Поскольку кормовые добавки разбавляют реакцию IVT, концентрация мРНК в IVT снижается при каждом вводе корма.
