لا يزال من الصعب تحديد ميكانيكا الخلايا التي تدفع تكوين الأوعية الدموية في الأنسجة الحية ثلاثية الأبعاد ، ومع ذلك فهو ضروري لمواصلة إحراز تقدم في مجال الطب التجديدي. يجعل هذا البروتوكول المهمة أكثر سهولة من خلال الجمع بين إمكانية الوصول إلى الأساليب الكمية ثنائية الأبعاد وتمثيلية الأنسجة ثلاثية الأبعاد. تقتصر الطرق الحالية لقياس القوى الخلوية أثناء إنبات الأوعية الدموية في الأنسجة الحية على استدلال قوة ثلاثية الأبعاد معقد ومكلف من الناحية الحسابية.
يربط بروتوكولنا التحكم في المختبر مع الصلة في الجسم الحي من خلال تكييف الفحص المجهري لقوة الجر لأنظمة X-vivo التي توفر طريقة سهلة الاستخدام ولكنها ذات صلة من الناحية الفسيولوجية لتوصيف القوة الميكانيكية الزمانية المكانية. يحافظ نموذج 2 Nav-D على السياق الفسيولوجي مع السماح بالتحليل الكمي للميكانيكا الخلوية ، مما يوفر نهجا فريدا لدراسة الميكانيكا التي تقود تكوين الأوعية الدموية. للبدء ، قم بإدخال 120 ميكرولترا من محلول السيلان في كل بئر من قاع زجاجي ، لوح 12 بئرا.
احتضن الطبق في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، اغسل الآبار ثلاث مرات بالإيثانول المطلق باستخدام زجاجة رذاذ ، وجفف اللوحة باستخدام غاز النيتروجين. ماصة 11.5 ميكرولتر من خليط بولي أكريلاميد أو هلام PAA المحضر حديثا على القاع الزجاجي لكل بئر.
ضع برفق زلة غطاء مقاس 13 ملم فوق كل قطرة. بعد البلمرة ، أضف PBS إلى البئر. باستخدام إبرة مثنية ، قم بفك زلة الغطاء برفق من جل PAA.
ثم استخدم الملقط لإزالة زلة الغطاء من البئر. أضف 75 ميكرولترا من ملليغرام واحد لكل مليلتر من السلفا سامبا ، المذاب في ماء فائق النقاء على المواد الهلامية PAA. ضع اللوحة تحت الأشعة فوق البنفسجية 365 نانومتر لمدة خمس دقائق.
شطف السلفا سامبا بسرعة على المواد الهلامية باستخدام PBS. ثم اغسل المواد الهلامية PAA الوظيفية مرتين باستخدام PBS لمدة 10 دقائق لكل منهما. ماصة 50 ميكرولتر من محلول الكولاجين 4 على المواد الهلامية PAA الوظيفية وتحتضن طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
في اليوم التالي ، اغسل المواد الهلامية مرتين باستخدام PBS واتركها تجف لمدة خمس دقائق. أضف 50 ميكرولترا من نمو الخلايا البطانية أو وسط تخطيط القلب فوق المواد الهلامية. احتضان اللوحة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة.
للبدء ، باستخدام ملاقط جراحية معقمة ، انقل الشريان السباتي الخنزير من زجاجة النقل التي تحتوي على محلول CREB المعدل إلى طبق بتري كبير مملوء ب PBS المعقم. قم بإزالة الأنسجة الزائدة المحيطة بالشريان السباتي باستخدام ملاقط جراحية ومشرط. اقطع سنتيمترين إلى ثلاثة سنتيمترات من طرفي الشريان باستخدام مشرط للقضاء على المناطق القريبة من تشعبات الشرايين.
بمساعدة ملاقط دقيقة ذات طرف دائري ومشرط ، قم بإزالة اللفافة الشريانية المحيطة بالشريان السباتي. باستخدام الملقط ، انقل الشريان السباتي النظيف إلى طبق بتري كبير جديد مليء ب PBS. قطع الشريان إلى حلقات بعرض ملليمترين تقريبا.
ثم انقل الحلقات إلى طبق بتري صغير مسخن مسبقا يحتوي على وسط تخطيط القلب. ضع الحلقات على 37 درجة مئوية. للبدء ، باستخدام ملاقط مستديرة الرأس ، انقل حلقة الشريان السباتي الخنزير من متوسط تخطيط القلب إلى طبق بتري متوسط الحجم مليء ب PBS.
بمساعدة ملاقط ذات طرف دائري ومشرط ، قم بقص الحلقة إلى نصفين ، ثم قم بتشريح نصف حلقة إلى صفائح بعرض ملليمترين تقريبا لإنشاء صفائح شريانية بأبعاد اثنين في ملليمترين. باستخدام ملاقط مستديرة الرأس ، أمسك الصفيحة الشريانية في الخلف وضع الورقة على حافة هلام PAA مع مواجهة البطانة الداخلية للركيزة PAA. بعد ذلك ، بمساعدة الملقط ، حرك الصفيحة الشريانية برفق إلى مركز هيدروجيل PAA دون لمس الجل.
أضف 50 ميكرولترا من وسط تخطيط القلب أعلى الصفيحة الشريانية مع ضمان بقاء القطرة على الجل. باستخدام الملقط ذو الرؤوس المستديرة ، ضع زلة غطاء جافة مقاس 13 ملم أعلى الصفيحة الشريانية على ركيزة PAA في الوسط. استخدم الحافة الداخلية للقاع الزجاجي لخفض انزلاق الغطاء برفق حتى تنتشر القطرة المتوسطة تحتها.
اسمح للأنسجة بالالتصاق عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة خمس ساعات. بعد ذلك ، أضف ملليلتر واحد من وسط تخطيط القلب إلى كل بئر. احتضان الصفيحة الشريانية على ركيزة PAA عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة.
في اليوم التالي ، باستخدام إبرة مثنية ، ارفع زلة الغطاء بعناية وقم بإزالتها من الصفيحة الشريانية باستخدام الملقط. قم بإزالة الوسط من البئر والأنسجة المحيطة باستخدام شفط فراغي دون لمس الأنسجة ، أضف قطرة 10 ميكرولتر من خليط جل الكولاجين من النوع 1 على كل ورقة شريانية. اترك الجل يتبلمر لمدة ساعة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد الحضانة ، أضف ملليلتر واحد من وسط تخطيط القلب المسخن مسبقا برفق إلى كل بئر. انقل اللوحة إلى حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 24 ساعة. لوحظت زيادة كفاءة ربط الصفائح الشريانية عند استخدام زلة غطاء غير معالجة مقاس 13 ملم ، مما يقلل من القوى الهائلة أثناء إزالتها.
بعد 24 ساعة من زراعة الشريان السباتي الخنازير في نظام 2.5D ، تحقق من تكوين الأوعية الدموية. إذا لوحظ تكوين الأوعية الدموية ، فقم بتحديث وسط تخطيط القلب وضع لوحة 12 جيدا في حامل المسرح داخل صندوق الحضانة الدافئ مسبقا بدرجة حرارة 37 درجة مئوية في المجهر. حدد هدف المجهر بناء على احتياجات التصوير.
اضبط وقت التعرض واضبط مستوى التركيز البؤري باستخدام تصوير تباين الطور. ثم أضف قناة الفلورسنت لتصوير حبات الفلورسنت واضبط وقت التعرض مرة أخرى. حدد مناطق متعددة ذات أهمية في العينة واضبط مستوى التركيز البؤري لكل موضع.
حدد الفاصل الزمني للفائدة عن طريق تحديد فاصل زمني من 5 إلى 20 دقيقة ومدة من 4 إلى 24 ساعة. قم بتشغيل نظام التركيز البؤري للحفاظ على تركيز بؤري ثابت طوال التصوير بفاصل زمني. بعد ذلك للفحص المجهري لقوة الجر ، أضف 5٪ SDS في الماء عالي النقاء إلى البئر وانتظر بضع دقائق حتى تنفصل الخلايا المتنامية.
احصل على كومة Z من علامات الفلورسنت في ركيزة PAA لكل موضع محدد للحصول على حالة مريحة لعلامات الفلورسنت كصورة مرجعية. باستخدام رموز MATLAB المخصصة ، حدد الصور ذات الفاصل الزمني والصور المرجعية لمعالجة الصور وحدد معلمات التحليل. قم بمحاذاة الصور ذات اللقطات المتتابعة واقتصاصها بالنسبة لأفضل صورة مرجعية لإجراء تحليل دقيق.
قم بقياس إزاحة علامات الفلورسنت في هيدروجيل PAA عن طريق إجراء عدم تناسق صورة الجسيمات بين صورة الفاصل الزمني والصورة المرجعية. قم بتكوين تحليل عدم تناسق الصورة لتقسيم الصور إلى نوافذ استجواب مقاس 32 × 32 بكسل مع تداخل 0.5. أخيرا ، احسب قوى الجر الخلوية بناء على الخصائص الميكانيكية لجل PAA.
لوحظ تكوين البراعم الخلوية ضمن النماذج 2.5D و 3D للصفيحة الشريانية الخنازير ، والتي تشبه أنماط الأوعية الدموية ، بينما لم يظهر النموذج ثنائي الأبعاد أي تكوين الأوعية الدموية. عززت صلابة الركيزة الناعمة لهيدروجيل PAA تكوين الأوعية الدموية في وقت مبكر من الإنبات الشرياني مقارنة بركيزة PAA الأكثر صلابة ، مما يدل على تأثيرات صلابة المصفوفة. كشف الفحص المجهري لقوة الجر أن البراعم الخلوية أظهرت قوى سحب عند النتوءات ودفع القوى على طول محور البرعم ، مدفوعة بخلايا القائد والتابع.
