Die Quantifizierung der Zellmechanik, die die sprießende Angiogenese in lebenden 3D-Geweben antreibt, ist immer noch schwierig, aber dennoch notwendig, um weitere Fortschritte auf dem Gebiet der regenerativen Medizin zu erzielen. Dieses Protokoll macht die Aufgabe zugänglicher, indem es die Zugänglichkeit quantitativer 2D-Methoden mit der Repräsentativität von 3D-Geweben kombiniert. Bestehende Methoden zur Quantifizierung zellulärer Kräfte während der angiogenen Keimung in lebendem Gewebe sind auf komplexe und rechenintensive 3D-Kraftinferenz beschränkt.
Unser Protokoll schlägt eine Brücke zwischen der In-vitro-Kontrolle und der in vivo-Relevanz, indem es die Zugkraftmikroskopie für X-vivo-Systeme adaptiert und bietet eine einfach zu bedienende und dennoch physiologisch relevante Methode zur Charakterisierung der räumlichen, zeitlichen mechanischen Kraft. 2 Das Nav-D-Modell bewahrt einen physiologischen Kontext und ermöglicht gleichzeitig eine quantitative Analyse der zellulären Mechanik und bietet einen einzigartigen Ansatz zur Untersuchung der Mechanik, die die sprießende Angiogenese antreibt. Pipettieren Sie zunächst 120 Mikroliter der Bindesilanlösung in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit Glasboden.
Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation die Vertiefungen dreimal mit absolutem Ethanol mit einer Sprühflasche waschen, die Platte mit Stickstoffgas trocknen. Pipettieren Sie 11,5 Mikroliter der frisch zubereiteten Polyacrylamid- oder PAA-Gelmischung auf den Glasboden jeder Vertiefung.
Legen Sie vorsichtig einen 13 Millimeter dicken Deckzettel auf jedes Tröpfchen. Nach der Polymerisation PBS in die Vertiefung geben. Lösen Sie mit einer gebogenen Nadel vorsichtig den Deckglas vom PAA-Gel.
Entfernen Sie dann mit einer Pinzette das Deckglas aus der Vertiefung. Geben Sie 75 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Sulfa-Sampa, gelöst in Reinstwasser, auf die PAA-Gele. Legen Sie die Platte fünf Minuten lang unter 365 Nanometer ultraviolettes Licht.
Spülen Sie den Sulfa Sampa schnell auf die Gele mit PBS ab. Waschen Sie dann die funktionalisierten PAA-Gele zweimal für jeweils 10 Minuten mit PBS. Pipettieren Sie 50 Mikroliter Kollagen-4-Lösung auf die funktionalisierten PAA-Gele und inkubieren Sie sie über Nacht bei vier Grad Celsius.
Waschen Sie die Gele am nächsten Tag zweimal mit PBS und lassen Sie sie fünf Minuten trocknen. Geben Sie 50 Mikroliter Endothelzellwachstum oder EKG-Medium auf die Gele. Inkubieren Sie die Platte eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid.
Übertragen Sie zunächst mit einer sterilen chirurgischen Pinzette die Halsschlagader des Schweins aus der Transportflasche mit der modifizierten CREB-Lösung in eine große Petrischale, die mit sterilem PBS gefüllt ist. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, das die Halsschlagader umgibt, mit einer chirurgischen Pinzette und einem Skalpell. Schneiden Sie mit einem Skalpell zwei bis drei Zentimeter von beiden Enden der Arterie ab, um Bereiche in der Nähe von Arteriengabelungen zu entfernen.
Entfernen Sie mit Hilfe einer feinen Pinzette mit runder Spitze und einem Skalpell die die Halsschlagader umgebende Arterienfaszie. Übertragen Sie die gereinigte Halsschlagader mit einer Pinzette in eine neue große Petrischale, die mit PBS gefüllt ist. Schneiden Sie die Arterie in etwa zwei Millimeter breite Ringe.
Übertragen Sie dann die Ringe in eine vorgewärmte kleine Petrischale, in der sich das EKG-Medium befindet. Platzieren Sie die Ringe bei 37 Grad Celsius. Übertragen Sie zunächst mit einer Pinzette mit runder Spitze den Karotisring des Schweins aus dem EKG-Medium in eine mittelgroße Petrischale, die mit PBS gefüllt ist.
Schneiden Sie den Ring mit Hilfe einer Pinzette mit runder Spitze und einem Skalpell in zwei Hälften und zerlegen Sie dann einen halben Ring in etwa zwei Millimeter breite Blätter, um arterielle Blätter mit den Maßen zwei mal zwei Millimeter zu erhalten. Halten Sie das arterielle Blatt mit einer Pinzette mit runder Spitze nach hinten und positionieren Sie das Blatt am Rand des PAA-Gels, wobei die endotheliale Innenauskleidung dem PAA-Substrat zugewandt ist. Bewegen Sie anschließend mit Hilfe einer Pinzette das arterielle Blatt vorsichtig in die Mitte des PAA-Hydrogels, ohne das Gel zu berühren.
Geben Sie 50 Mikroliter EKG-Medium auf das arterielle Blatt und stellen Sie sicher, dass das Tröpfchen auf dem Gel verbleibt. Legen Sie mit der Pinzette mit runder Spitze einen trockenen 13-Millimeter-Deckzettel auf das arterielle Blatt auf dem PAA-Substrat im Medium. Verwenden Sie den inneren Rand des Glasbodens, um den Deckglas vorsichtig abzusenken, bis sich das mittlere Tröpfchen darunter ausbreitet.
Lassen Sie das Gewebe fünf Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid anhaften. Geben Sie anschließend einen Milliliter EKG-Medium in jede Vertiefung. Inkubieren Sie das arterielle Blatt auf dem PAA-Substrat bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid für 24 Stunden.
Heben Sie am nächsten Tag mit einer gebogenen Nadel vorsichtig das Deckglas an und entfernen Sie es mit einer Pinzette von der Arterienfolie. Entfernen Sie das Medium mit einem Vakuumsauger aus der Vertiefung und dem umgebenden Gewebe, ohne das Gewebe zu berühren, und geben Sie einen 10-Mikroliter-Tropfen Kollagen-Typ-1-Gelmischung auf jedes arterielle Blatt. Lassen Sie das Gel eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid polymerisieren.
Geben Sie nach der Inkubation vorsichtig einen Milliliter vorgewärmtes EKG-Medium in jede Vertiefung. Stellen Sie die Platte für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid in einen Inkubator. Eine erhöhte Befestigungseffizienz von arteriellen Blättern wurde beobachtet, wenn ein 13 Millimeter unbehandelter Deckglas verwendet wurde, wodurch die Scherkräfte während der Entfernung minimiert wurden.
Nach 24-stündiger Kultur der Schweine-Halsschlagader im 2,5D-System ist zu prüfen, ob eine Keimangiogenese vorliegt. Wenn eine keimende Angiogenese beobachtet wird, aktualisieren Sie das EKG-Medium und platzieren Sie die 12-Well-Platte in der Tischhalterung in der 37 Grad Celsius vorgewärmten Inkubationsbox des Mikroskops. Wählen Sie das Mikroskopobjektiv basierend auf den Bildgebungsanforderungen aus.
Stellen Sie die Belichtungszeit ein und stellen Sie die Fokusebene mit Hilfe der Phasenkontrastbildgebung ein. Fügen Sie dann den Fluoreszenzkanal für die Abbildung der fluoreszierenden Kügelchen hinzu und stellen Sie die Belichtungszeit erneut ein. Wählen Sie mehrere interessante Bereiche im Sample aus und passen Sie die Fokusebene für jede Position an.
Definieren Sie den interessierenden Zeitraffer, indem Sie ein Zeitintervall von 5 bis 20 Minuten und eine Dauer von 4 bis 24 Stunden auswählen. Schalten Sie das Fokussystem ein, um während der gesamten Zeitrafferaufnahme einen stabilen Fokus zu erhalten. Geben Sie als nächstes für die Zugkraftmikroskopie 5 % SDS in Reinstwasser in die Vertiefung und warten Sie einige Minuten, bis sich die herauswachsenden Zellen abgelöst haben.
Erfassen Sie für jede ausgewählte Position einen Z-Stapel von Fluoreszenzmarkern im PAA-Substrat, um einen entspannten Zustand der Fluoreszenzmarker als Referenzbild zu erhalten. Mit benutzerdefinierten MATLAB-Codes können Sie Zeitraffer- und Referenzbilder für die Bildverarbeitung auswählen und Parameter für die Analyse definieren. Richten Sie die Zeitrafferbilder relativ zum besten Referenzbild aus und schneiden Sie sie zu, um eine präzise Analyse zu gewährleisten.
Messen Sie die Verschiebung von Fluoreszenzmarkern im PAA-Hydrogel, indem Sie eine Partikelbild-Vel-Asymmetrie zwischen dem Zeitrafferbild und dem Referenzbild durchführen. Konfigurieren Sie die Bildvel-Asymmetrie-Analyse, um die Bilder in Abfragefenster von 32 x 32 Pixeln mit einer Überlappung von 0,5 zu unterteilen. Berechnen Sie abschließend die zellulären Zugkräfte basierend auf den mechanischen Eigenschaften des PAA-Gels.
Die Bildung von zellulären Sprossen wurde in den 2,5D- und 3D-Modellen der arteriellen Schicht des Schweins beobachtet, die angiogenen Mustern ähneln, während das 2D-Modell keine sprießende Angiogenese zeigte. Die Steifigkeit des weichen Substrats des PAA-Hydrogels förderte die frühe Angiogenese der arteriellen Keimung im Vergleich zu einem steiferen PAA-Substrat und zeigte Effekte auf die Matrixsteifigkeit. Die Zugkraftmikroskopie zeigte, dass zelluläre Sprossen Zugkräfte an Vorsprüngen und Schubkräfte entlang der Sprossenachse zeigten, angetrieben von Vor- und Nachlaufzellen.
