Quantifier la mécanique cellulaire qui entraîne la germination de l’angiogenèse dans les tissus vivants en 3D est encore difficile, mais il est nécessaire de continuer à progresser dans le domaine de la médecine régénérative. Ce protocole rend la tâche plus accessible en combinant l’accessibilité des méthodes quantitatives 2D avec la représentativité des tissus 3D. Les méthodes existantes de quantification des forces cellulaires lors de la germination angiogénique dans les tissus vivants se limitent à l’inférence de force 3D complexe et coûteuse en calcul.
Notre protocole fait le lien entre le contrôle in vitro et la pertinence in vivo en adaptant la microscopie à force de traction aux systèmes X-vivo, offrant une méthode facile à utiliser mais physiologiquement pertinente pour la caractérisation de la force mécanique spatio-temporelle. 2 Le modèle Nav-D préserve un contexte physiologique tout en permettant une analyse quantitative de la mécanique cellulaire, offrant une approche unique pour étudier la mécanique à l’origine de l’angiogenèse germinative. Pour commencer, pipetez 120 microlitres de la solution de silane de liaison dans chaque puits d’une plaque à fond de verre à 12 puits.
Incuber la plaque à température ambiante pendant une heure. Après l’incubation, lavez les puits trois fois avec de l’éthanol absolu à l’aide d’un vaporisateur, séchez la plaque avec de l’azote gazeux. Pipette 11,5 microlitres du mélange de gel de polyacrylamide ou de PAA fraîchement préparé sur le fond en verre de chaque puits.
Placez délicatement une lamelle de 13 millimètres sur chaque gouttelette. Après la polymérisation, ajoutez du PBS dans le puits. À l’aide d’une aiguille pliée, desserrez doucement la lamelle du gel PAA.
Ensuite, utilisez une pince à épiler pour retirer la lamelle du puits. Ajoutez 75 microlitres d’un milligramme par millilitre de sulfa sampa, dissous dans de l’eau ultrapure sur les gels PAA. Placez la plaque sous une lumière ultraviolette de 365 nanomètres pendant cinq minutes.
Rincez rapidement le sulfamide sampa sur les gels avec du PBS. Lavez ensuite les gels PAA fonctionnalisés deux fois avec du PBS pendant 10 minutes chacun. Pipetez 50 microlitres de solution de collagène 4 sur les gels PAA fonctionnalisés et incubez pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Le lendemain, lavez les gels deux fois avec du PBS et laissez-les sécher pendant cinq minutes. Ajoutez 50 microlitres de croissance cellulaire endothéliale ou de milieu ECG sur les gels. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure.
Pour commencer, à l’aide d’une pince chirurgicale stérile, transférez l’artère carotide porcine du flacon de transport contenant une solution de CREB modifiée dans une grande boîte de Pétri remplie de PBS stérile. Retirez l’excès de tissu entourant l’artère carotide à l’aide d’une pince à épiler chirurgicale et d’un scalpel. Coupez deux à trois centimètres des deux extrémités de l’artère à l’aide d’un scalpel pour éliminer les zones proches des bifurcations des artères.
À l’aide d’une pince à épiler fine à bout rond et d’un scalpel, retirez le fascia artériel entourant l’artère carotide. À l’aide d’une pince à épiler, transférez l’artère carotide nettoyée dans une nouvelle grande boîte de Pétri remplie de PBS. Coupez l’artère en anneaux d’environ deux millimètres de large.
Transférez ensuite les anneaux dans une petite boîte de Pétri préchauffée contenant un moyen ECG. Placez les anneaux à 37 degrés Celsius. Pour commencer, à l’aide d’une pince à épiler à bout rond, transférez l’anneau de l’artère carotide porcine du milieu ECG dans une boîte de Pétri de taille moyenne remplie de PBS.
À l’aide d’une pince à épiler à bout rond et d’un scalpel, coupez l’anneau en deux, puis disséquez un demi-anneau en feuilles d’environ deux millimètres de largeur pour créer des feuilles artérielles de dimensions de deux par deux millimètres. À l’aide d’une pince à épiler à bout rond, tenez la feuille artérielle à l’arrière et positionnez la feuille sur le bord du gel PAA avec la doublure endothéliale face au substrat PAA. Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, déplacez doucement la feuille artérielle vers le centre de l’hydrogel PAA sans toucher le gel.
Ajoutez 50 microlitres de moyen ECG sur le dessus de la feuille artérielle tout en veillant à ce que la gouttelette reste sur le gel. À l’aide de la pince à épiler à bout rond, placez une lamelle sèche de 13 millimètres sur la feuille artérielle sur le substrat PAA dans le milieu. Utilisez le bord intérieur du fond en verre pour abaisser doucement la lamelle jusqu’à ce que la gouttelette moyenne se propage en dessous.
Laissez le tissu se fixer à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq heures. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu ECG dans chaque puits. Incuber la feuille artérielle sur le substrat PAA à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures.
Le lendemain, à l’aide d’une aiguille pliée, soulevez délicatement la lamelle et retirez-la de la feuille artérielle à l’aide d’une pince à épiler. Retirez le milieu du puits et des tissus environnants à l’aide d’une aspiration sous vide sans toucher les tissus, ajoutez une gouttelette de 10 microlitres de mélange de gel de collagène de type 1 sur chaque feuillet artériel. Laissez le gel polymériser pendant une heure à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.
Après l’incubation, ajoutez délicatement un millilitre de milieu ECG préchauffé dans chaque puits. Transférez l’assiette dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant 24 heures. Une efficacité accrue de fixation des feuilles artérielles a été observée lorsqu’une lamelle de couverture non traitée de 13 millimètres a été utilisée, minimisant ainsi les forces lors de son retrait.
Après 24 heures de culture de l’artère carotide porcine dans le système 2.5D, vérifiez l’angiogenèse germinative. Si une angiogenèse germinative est observée, rafraîchissez le milieu ECG et placez la plaque à 12 puits dans le support de platine à l’intérieur de la boîte d’incubation préchauffée à 37 degrés Celsius du microscope. Sélectionnez l’objectif du microscope en fonction des besoins d’imagerie.
Réglez le temps d’exposition et ajustez le plan de mise au point à l’aide de l’imagerie à contraste de phase. Ajoutez ensuite le canal fluorescent pour l’imagerie des billes fluorescentes et réglez à nouveau le temps d’exposition. Sélectionnez plusieurs régions d’intérêt dans l’échantillon et ajustez le plan de mise au point pour chaque position.
Définissez le time-lapse qui vous intéresse en sélectionnant un intervalle de temps de 5 à 20 minutes et une durée de 4 à 24 heures. Activez le système de mise au point pour maintenir une mise au point stable tout au long de l’imagerie en accéléré. Ensuite, pour la microscopie à force de traction, ajoutez 5 % de SDS dans de l’eau ultrapure dans le puits et attendez quelques minutes que les cellules en croissance se détachent.
Acquérez une pile Z de marqueurs fluorescents dans le substrat PAA pour chaque position sélectionnée afin d’obtenir un état détendu des marqueurs fluorescents comme image de référence. À l’aide de codes MATLAB personnalisés, sélectionnez des images time-lapse et de référence pour le traitement d’image, puis définissez des paramètres d’analyse. Alignez et recadrez les images time-lapse par rapport à la meilleure image de référence Pour une analyse précise.
Mesurez le déplacement des marqueurs fluorescents dans l’hydrogel PAA en effectuant une asymétrie vel de l’image de particules entre l’image en accéléré et l’image de référence. Configurez l’analyse d’asymétrie d’image pour diviser les images en fenêtres d’interrogation de 32 par 32 pixels avec un chevauchement de 0,5. Enfin, calculez les forces de traction cellulaires en fonction des propriétés mécaniques du gel PAA.
La formation de germes cellulaires a été observée dans les modèles 2,5D et 3D de la feuille artérielle porcine, ressemblant à des motifs angiogéniques, tandis que le modèle 2D n’a montré aucune angiogenèse germinative. La rigidité du substrat mou de l’hydrogel PAA a favorisé l’angiogenèse de germination artérielle précoce par rapport à un substrat PAA plus rigide, démontrant des effets de rigidité matricielle. La microscopie à force de traction a révélé que les germes cellulaires présentaient des forces de traction au niveau des protubérances et des forces de poussée le long de l’axe de la germination, entraînées par des cellules leaders et suiveuses.
