3D canlı dokularda filizlenme Anjiyogenezini yönlendiren hücre mekaniğini ölçmek hala zordur ve yine de rejeneratif tıp alanında ilerleme kaydetmeye devam etmek için gereklidir. Bu protokol, 2B kantitatif yöntemlerin erişilebilirliğini 3B dokuların temsiliyeti ile birleştirerek görevi daha ulaşılabilir hale getirir. Canlı dokuda anjiyojenik filizlenme sırasında hücresel kuvvetlerin ölçülmesi için mevcut yöntemler, karmaşık ve hesaplama açısından pahalı 3D kuvvet çıkarımı ile sınırlıdır.
Protokolümüz, X-vivo sistemler için çekiş kuvveti mikroskobunu uyarlayarak in vitro kontrol ile in vivo alaka düzeyi arasında köprü kurar ve mekansal zamansal mekanik kuvvet karakterizasyonu için kullanımı kolay ancak fizyolojik olarak ilgili bir yöntem sunar. 2 Nav-D modeli, hücresel mekaniğin kantitatif analizine izin verirken fizyolojik bir bağlamı korur ve filizlenme anjiyogenezi yönlendiren mekaniği incelemek için benzersiz bir yaklaşım sunar. Başlamak için, 120 mikrolitre bağlayıcı silan çözeltisini cam tabanlı, 12 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna pipetleyin.
Plakayı oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. İnkübasyondan sonra, kuyuları bir sprey şişesi kullanarak mutlak etanol ile üç kez yıkayın, plakayı nitrojen gazı kullanarak kurutun. Taze hazırlanmış poliakrilamid veya PAA jel karışımından 11,5 mikrolitre pipetleyin ve her bir kuyucuğun cam tabanına pipetleyin.
Her damlacığın üzerine yavaşça 13 milimetrelik bir kapak fişi yerleştirin. Polimerizasyondan sonra, kuyuya PBS ekleyin. Bükülmüş bir iğne kullanarak, PAA jelinden kapak kızağını nazikçe gevşetin.
Ardından kapak fişini kuyudan çıkarmak için cımbız kullanın. PAA jellerinin üzerine ultra saf suda çözülmüş mililitre sulfa sampa başına 75 mikrolitre bir miligram ekleyin. Plakayı beş dakika boyunca 365 nanometre ultraviyole ışığın altına yerleştirin.
Jellerin üzerindeki sülfa sampasını PBS ile hızlıca durulayın. Daha sonra işlevselleştirilmiş PAA jellerini PBS ile her biri 10 dakika boyunca iki kez yıkayın. 50 mikrolitre kollajen 4 solüsyonunu işlevselleştirilmiş PAA jellerine pipetleyin ve gece boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.
Ertesi gün, jelleri PBS ile iki kez yıkayın ve beş dakika kurumaya bırakın. Jellerin üzerine 50 mikrolitre endotel hücre büyümesi veya EKG ortamı ekleyin. Plakayı bir saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Başlamak için, steril cerrahi cımbız kullanarak, domuz karotis arterini modifiye CREB çözeltisi içeren taşıma şişesinden steril PBS ile doldurulmuş büyük bir Petri kabına aktarın. Cerrahi cımbız ve neşter kullanarak karotis arteri çevreleyen fazla dokuyu çıkarın. Arter çatallanmalarına yakın alanları ortadan kaldırmak için bir neşter kullanarak arterin her iki ucundan iki ila üç santimetre kesin.
İnce yuvarlak uçlu cımbız ve neşter yardımıyla, karotis arteri çevreleyen arteriyel fasyayı çıkarın. Cımbız kullanarak, temizlenmiş karotis arteri PBS ile doldurulmuş yeni bir büyük Petri kabına aktarın. Arteri yaklaşık iki milimetre genişliğinde halkalar halinde kesin.
Daha sonra halkaları EKG ortamı içeren önceden ısıtılmış küçük bir Petri kabına aktarın. Halkaları 37 santigrat dereceye yerleştirin. Başlamak için, yuvarlak uçlu cımbız kullanarak, domuz karotis arter halkasını EKG ortamından PBS ile doldurulmuş orta büyüklükte bir Petri kabına aktarın.
Yuvarlak uçlu cımbız ve bir neşter yardımıyla, halkayı ikiye bölün, ardından iki ila iki milimetre boyutlarında arteriyel tabakalar oluşturmak için yarım halkayı yaklaşık iki milimetre genişliğinde tabakalar halinde inceleyin. Yuvarlak uçlu cımbız kullanarak, arteriyel tabakayı arkada tutun ve tabakayı, endotelyal iç astar PAA substratına bakacak şekilde PAA jelinin kenarına yerleştirin. Daha sonra, cımbız yardımıyla, arteriyel tabakayı jele dokunmadan yavaşça PAA hidrojelin merkezine doğru hareket ettirin.
Damlacığın jel üzerinde kalmasını sağlarken arteriyel tabakanın üstüne 50 mikrolitre EKG ortamı ekleyin. Yuvarlak uçlu cımbızı kullanarak, ortamdaki PAA substratı üzerindeki arteriyel tabakanın üzerine 13 milimetrelik kuru bir kapak fişi yerleştirin. Orta damlacık altına yayılana kadar kapak kızağını nazikçe indirmek için cam tabanın iç kenarını kullanın.
Dokunun beş saat boyunca 37 santigrat derecede ve% 5 karbondioksitte bağlanmasına izin verin. Daha sonra, her kuyucuğa bir mililitre EKG ortamı ekleyin. PAA substratı üzerindeki arteriyel tabakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte inkübe edin.
Ertesi gün, bükülmüş bir iğne kullanarak, kapak fişini dikkatlice kaldırın ve cımbızla arteriyel tabakadan çıkarın. Dokuya dokunmadan bir vakum emme kullanarak ortamı kuyudan ve çevresindeki dokudan çıkarın, her bir arteriyel tabakaya 10 mikrolitrelik bir damla kollajen tip 1 jel karışımı ekleyin. Jelenin 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir saat polimerize olmasına izin verin.
İnkübasyondan sonra, her bir oyuğa nazikçe bir mililitre önceden ısıtılmış EKG ortamı ekleyin. Plakayı 24 saat boyunca 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte bir inkübatöre aktarın. 13 milimetre işlenmemiş bir kapak kayması kullanıldığında, arteriyel tabakaların artan bağlanma verimliliği gözlendi ve çıkarılması sırasında saf kuvvetleri en aza indirdi.
2.5D sisteminde 24 saatlik domuz karotis arter kültüründen sonra, filizlenme anjiyogenezi kontrol edin. Filizlenme anjiyogenezi gözlenirse, EKG ortamını yenileyin ve 12 oyuklu plakayı, mikroskobun 37 santigrat derece önceden ısıtılmış inkübasyon kutusu içindeki sahne tutucusuna yerleştirin. Görüntüleme ihtiyaçlarına göre mikroskop objektifini seçin.
Faz kontrast görüntülemeyi kullanarak pozlama süresini ayarlayın ve odak düzlemini ayarlayın. Ardından, floresan boncukların görüntülenmesi için floresan kanalını ekleyin ve pozlama süresini tekrar ayarlayın. Örnekte birden fazla ilgi alanı seçin ve her konum için odak düzlemini ayarlayın.
5 ila 20 dakikalık bir zaman aralığı ve 4 ila 24 saatlik bir süre seçerek ilgilenilen zaman atlamalı süreyi tanımlayın. Zaman atlamalı görüntüleme boyunca sabit bir odak sağlamak için odak sistemini açın. Çekiş kuvveti mikroskobu için daha sonra, kuyuya ultra saf su içinde% 5 SDS ekleyin ve büyüyen hücrelerin ayrılması için birkaç dakika bekleyin.
Referans görüntü olarak floresan işaretleyicilerin rahat bir durumunu elde etmek için seçilen her konum için PAA alt tabakasında bir Z floresan işaretleyici yığını edinin. Özelleştirilmiş MATLAB kodlarını kullanarak, görüntü işleme için hızlandırılmış ve referans görüntüleri seçin ve analiz için parametreleri tanımlayın. Hassas analiz için hızlandırılmış görüntüleri en iyi referans görüntüye göre hizalayın ve kırpın.
Zaman atlamalı görüntü ile referans görüntü arasında parçacık görüntü vel asimetrisi gerçekleştirerek PAA hidrojel içindeki floresan işaretleyicilerin yer değiştirmesini ölçün. Görüntüleri 0,5 örtüşme ile 32 x 32 piksellik sorgulama pencerelerine bölmek için görüntü vel asimetri analizini yapılandırın. Son olarak, PAA jelinin mekanik özelliklerine dayalı olarak hücresel çekiş kuvvetlerini hesaplayın.
Domuz arter tabakasının 2.5D ve 3D modellerinde, anjiyojenik modellere benzeyen hücresel filizlerin oluşumu gözlenirken, 2D model filizlenme anjiyogenezi göstermedi. PAA hidrojelin yumuşak substrat sertliği, daha sert bir PAA substratına kıyasla erken arteriyel filizlenme anjiyogenezini teşvik etti ve matris sertliği etkilerini gösterdi. Çekiş kuvveti mikroskobu, hücresel filizlerin, lider ve takipçi hücreler tarafından yönlendirilen çıkıntılarda çekme kuvvetleri ve filiz ekseni boyunca itme kuvvetleri sergilediğini ortaya koydu.
