כימות מכניקת התא המניעה אנגיוגנזה מונבטת ברקמות חיות תלת-ממדיות עדיין קשה, ובכל זאת הכרחי כדי להמשיך להתקדם בתחום הרפואה הרגנרטיבית. פרוטוקול זה הופך את המשימה לנגישה יותר על ידי שילוב הנגישות של שיטות כמותיות דו-ממדיות עם ייצוגיות של רקמות תלת מימדיות. השיטות הקיימות לכימות הכוחות התאיים במהלך הנבטה אנגיוגנית ברקמה חיה מוגבלות להסקת כוח תלת מימדית מורכבת ויקרה מבחינה חישובית.
הפרוטוקול שלנו מגשר בין בקרת מבחנה לרלוונטיות in vivo על ידי התאמת מיקרוסקופ כוח משיכה למערכות X-vivo המציע שיטה קלה לשימוש אך רלוונטית מבחינה פיזיולוגית לאפיון כוח מכני זמני מרחבי. 2 מודל Nav-D שומר על הקשר פיזיולוגי תוך שהוא מאפשר ניתוח כמותי של מכניקת התא, ומציע גישה ייחודית לחקר המכניקה המניעה אנגיוגנזה של נביטה. כדי להתחיל, פיפטה 120 מיקרוליטר מתמיסת הסילאן הקשורה לכל באר של תחתית זכוכית, צלחת 12 בארות.
דוגרים את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה. לאחר הדגירה יש לשטוף את הבארות שלוש פעמים באתנול מוחלט באמצעות בקבוק ריסוס, לייבש את הצלחת באמצעות גז חנקן. פיפטה 11.5 מיקרוליטר מתערובת הג'ל הטרי של פוליאקרילאמיד או PAA על תחתית הזכוכית של כל באר.
יש להניח בעדינות כיסוי בקוטר 13 מ"מ על גבי כל טיפה. לאחר פילמור, הוסף PBS לבאר. בעזרת מחט כפופה, שחרר בעדינות את החלקת הכיסוי מג'ל PAA.
לאחר מכן השתמש בפינצטה כדי להסיר את החלקת הכיסוי מהבאר. הוסף 75 מיקרוליטר של מיליגרם אחד למיליליטר סולפה סמפה, מומס במים טהורים במיוחד על ג'לי PAA. הנח את הצלחת תחת אור אולטרה סגול של 365 ננומטר למשך חמש דקות.
שוטפים במהירות את סמפה הסולפה על הג'לים בעזרת PBS. לאחר מכן שטפו את ג'לי ה-PAA הפונקציונליים פעמיים עם PBS למשך 10 דקות כל אחד. פיפטה 50 מיקרוליטר של תמיסת קולגן 4 על ג'ל ה-PAA הפונקציונלי ודגירה למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
למחרת, שטפו את הג'לים פעמיים עם PBS והניחו להם להתייבש במשך חמש דקות. הוסף 50 מיקרוליטר של צמיחת תאי אנדותל או מדיום א.ק.ג על גבי הג'לים. דגרו את הצלחת בחום של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך שעה.
כדי להתחיל, באמצעות פינצטה כירורגית סטרילית, העבירו את עורק הצוואר החזירי מבקבוק ההובלה המכיל תמיסת CREB שונה לצלחת פטרי גדולה מלאה ב-PBS סטרילי. הסר רקמות עודפות המקיפות את עורק הצוואר באמצעות פינצטה כירורגית ואזמל. חתכו שניים עד שלושה סנטימטרים משני קצוות העורק באמצעות אזמל כדי לחסל אזורים ליד התפצלות העורקים.
בעזרת פינצטה עגולה עדינה ואזמל, הסר את הפאשיה העורקית המקיפה את עורק הצוואר. בעזרת פינצטה מעבירים את עורק הצוואר הנקי לצלחת פטרי גדולה חדשה מלאה ב- PBS. חותכים את העורק לטבעות ברוחב של כשני מילימטרים.
לאחר מכן מעבירים את הטבעות לצלחת פטרי קטנה שחוממה מראש המכילה מדיום א.ק.ג. מניחים את הרינגים בחום של 37 מעלות צלזיוס. כדי להתחיל, בעזרת פינצטה עם קצה עגול, העבירו את טבעת עורק הצוואר החזירי ממדיום האק"ג לצלחת פטרי בגודל בינוני מלא ב-PBS.
בעזרת פינצטה עגולה ואזמל, חותכים את הטבעת לשניים, ואז מנתחים חצי טבעת ליריעות ברוחב של כשני מילימטרים ליצירת יריעות עורקים במידות של שניים על שני מילימטרים. בעזרת פינצטה עם קצה עגול, החזק את יריעת העורקים מאחור ומקם את הסדין בקצה ג'ל PAA כאשר הציפוי הפנימי של האנדותל פונה למצע PAA. לאחר מכן, בעזרת פינצטה, העבירו את יריעת העורקים בעדינות למרכז ההידרוג'ל PAA מבלי לגעת בג'ל.
הוסף 50 מיקרוליטר של מדיום א.ק.ג על גבי יריעת העורקים תוך הקפדה על הטיפה להישאר על הג'ל. בעזרת הפינצטה העגולה, הניחו החלקת כיסוי יבשה של 13 מילימטר על גבי יריעת העורקים על מצע ה-PAA במדיום. השתמש בשפה הפנימית של תחתית הזכוכית כדי להוריד בעדינות את החלקת המכסה עד שהטיפה הבינונית מתפשטת מתחת.
אפשר לרקמה להיצמד ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך חמש שעות. לאחר מכן, הוסף מיליליטר אחד של מדיום א.ק.ג לכל באר. דגרו את יריעת העורקים על מצע ה-PAA ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות.
למחרת, בעזרת מחט כפופה, הרם בזהירות את החלקה של הכיסוי והסר אותה מיריעת העורקים בעזרת פינצטה. הסר את המדיום מהבאר ומהרקמות שמסביב באמצעות יניקת ואקום מבלי לגעת ברקמה, הוסף טיפה של 10 מיקרוליטר של תערובת ג'ל קולגן מסוג 1 על כל יריעת עורק. הניחו לג'ל להתפלמר למשך שעה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.
לאחר הדגירה, יש להוסיף בעדינות מיליליטר אחד של מדיום א.ק.ג שחומם מראש לכל באר. העבירו את הצלחת לחממה בחום של 37 מעלות צלזיוס ו -5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. יעילות הצמדה מוגברת של יריעות עורקים נצפתה כאשר נעשה שימוש בהחלקת כיסוי לא מטופלת של 13 מילימטר, מה שממזער את הכוחות העצומים במהלך הסרתו.
לאחר 24 שעות של תרבית עורק הצוואר החזירי במערכת 2.5D, בדוק אם יש אנגיוגנזה מונבטת. אם נצפתה אנגיוגנזה מונבטת, רענן את מדיום האק"ג והנח את צלחת 12 הבארות במחזיק הבמה בתוך קופסת הדגירה המחוממת מראש של 37 מעלות צלזיוס של המיקרוסקופ. בחר את מטרת המיקרוסקופ על סמך צרכי ההדמיה.
הגדר את זמן החשיפה והתאם את מישור המיקוד באמצעות הדמיית ניגודיות פאזה. לאחר מכן הוסף את תעלת הפלואורסצנט להדמיה של חרוזי הפלואורסצנט והגדר שוב את זמן החשיפה. בחר אזורי עניין מרובים בדגימה והתאם את מישור המיקוד עבור כל מיקום.
הגדר את קיטועי הזמן של עניין על-ידי בחירת מרווח זמן של 5 עד 20 דקות ומשך זמן של 4 עד 24 שעות. הפעל את מערכת המיקוד כדי לשמור על מיקוד יציב לאורך כל הדמיית דולג הזמן. לאחר מכן למיקרוסקופ כוח משיכה, הוסף לבאר 5% SDS במים טהורים במיוחד והמתן מספר דקות עד שהתאים הגדלים יתנתקו.
רכוש ערימת Z של סמני פלורסנט במצע PAA עבור כל מיקום שנבחר כדי לקבל מצב רגוע של הסמנים הפלואורסצנטיים כתמונת הייחוס. באמצעות קודי MATLAB מותאמים אישית, בחר תמונות זמן-lapse והתייחסות לעיבוד תמונה והגדר פרמטרים לניתוח. יישור וחיתוך של תמונות דולג זמן ביחס לתמונת הייחוס הטובה ביותר לניתוח מדויק.
מדוד את התזוזה של סמני פלואורסצנט בהידרוג'ל PAA על ידי ביצוע אסימטריה של תמונת חלקיקים בין תמונת הזמן-lapse לתמונת הייחוס. הגדר את ניתוח אסימטריית התמונה כדי לחלק את התמונות לחלונות חקירה של 32 על 32 פיקסלים עם חפיפה של 0.5. לבסוף, חשב את כוחות המתיחה התאיים על סמך התכונות המכניות של ג'ל PAA.
היווצרות נבטים תאיים נצפתה במודלים 2.5D ו-3D של יריעת העורקים החזירית, הדומים לדפוסים אנגיוגניים, בעוד שהמודל הדו-ממדי לא הראה אנגיוגנזה של נביטה. נוקשות המצע הרך של הידרוג'ל PAA קידמה אנגיוגנזה מוקדמת של נביטת עורקים בהשוואה למצע PAA נוקשה יותר, והדגימה השפעות נוקשות מטריצה. מיקרוסקופ כוח המתיחה גילה כי נבטים תאיים הפגינו כוחות משיכה בבליטות וכוחות דחיפה לאורך ציר הנבט, המונעים על ידי תאים מובילים ועוקבים.
