Quantificar a mecânica celular que impulsiona a angiogênese germinada em tecidos vivos 3D ainda é difícil e, no entanto, é necessário continuar progredindo no campo da medicina regenerativa. Este protocolo torna a tarefa mais acessível, combinando a acessibilidade de métodos quantitativos 2D com a representatividade de tecidos 3D. Os métodos existentes para a quantificação de forças celulares durante a germinação angiogênica em tecidos vivos são limitados à inferência de força 3D complexa e computacionalmente cara.
Nosso protocolo une o controle in vitro com a relevância in vivo, adaptando a microscopia de força de tração para sistemas X-vivo, oferecendo um método fácil de usar, mas fisiologicamente relevante, para caracterização espacial e temporal da força mecânica. 2 O modelo Nav-D preserva um contexto fisiológico enquanto permite a análise quantitativa da mecânica celular, oferecendo uma abordagem única para estudar a mecânica que impulsiona a angiogênese germinada. Para começar, pipete 120 microlitros da solução de silano de ligação em cada poço de uma placa de 12 poços com fundo de vidro.
Incube a placa em temperatura ambiente por uma hora. Após a incubação, lave os poços três vezes com etanol absoluto usando um borrifador, seque a placa com gás nitrogênio. Pipete 11,5 microlitros da mistura de poliacrilamida ou gel de PAA recém-preparada no fundo de vidro de cada poço.
Coloque delicadamente uma lamínula de 13 milímetros em cima de cada gota. Após a polimerização, adicione PBS ao poço. Usando uma agulha dobrada, solte suavemente a lamínula do gel PAA.
Em seguida, use uma pinça para remover a lamínula do poço. Adicione 75 microlitros de um miligrama por mililitro de sulfa sampa, dissolvido em água ultrapura aos géis de PAA. Coloque a placa sob luz ultravioleta de 365 nanômetros por cinco minutos.
Enxágue rapidamente a sulfa sampa nos géis com PBS. Em seguida, lave os géis de PAA funcionalizados duas vezes com PBS por 10 minutos cada. Pipete 50 microlitros de solução de colágeno 4 nos géis de PAA funcionalizados e incube durante a noite a quatro graus Celsius.
No dia seguinte, lave os géis duas vezes com PBS e deixe-os secar por cinco minutos. Adicione 50 microlitros de crescimento de células endoteliais ou meio de ECG em cima dos géis. Incube a placa a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por uma hora.
Para começar, usando uma pinça cirúrgica estéril, transfira a artéria carótida suína do frasco de transporte contendo solução de CREB modificada para uma grande placa de Petri cheia de PBS estéril. Remova o excesso de tecido ao redor da artéria carótida usando uma pinça cirúrgica e um bisturi. Corte dois a três centímetros de ambas as extremidades da artéria usando um bisturi para eliminar áreas próximas às bifurcações das artérias.
Com a ajuda de uma pinça fina de ponta redonda e um bisturi, remova a fáscia arterial ao redor da artéria carótida. Usando uma pinça, transfira a artéria carótida limpa para uma nova placa de Petri grande cheia de PBS. Corte a artéria em anéis de aproximadamente dois milímetros de largura.
Em seguida, transfira os anéis para uma pequena placa de Petri pré-aquecida contendo meio de ECG. Coloque os anéis a 37 graus Celsius. Para começar, usando uma pinça de ponta redonda, transfira o anel da artéria carótida suína do meio de ECG para uma placa de Petri de tamanho médio cheia de PBS.
Com a ajuda de uma pinça de ponta redonda e um bisturi, corte o anel ao meio e, em seguida, disseque meio anel em folhas de aproximadamente dois milímetros de largura para criar folhas arteriais com dimensões de dois por dois milímetros. Usando uma pinça de ponta redonda, segure a lâmina arterial na parte de trás e posicione a folha na borda do gel de PAA com o revestimento interno endotelial voltado para o substrato de PAA. Em seguida, com a ajuda de uma pinça, mova a lâmina arterial suavemente para o centro do hidrogel de PAA sem tocar no gel.
Adicione 50 microlitros de meio de ECG em cima da folha arterial, garantindo que a gota permaneça no gel. Usando a pinça de ponta redonda, coloque uma lamínula seca de 13 milímetros em cima da lâmina arterial no substrato PAA no meio. Use a borda interna do fundo de vidro para abaixar suavemente a lamínula até que a gota média se espalhe por baixo.
Deixe o tecido se fixar a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por cinco horas. Depois, adicione um mililitro de meio de ECG a cada poço. Incube a lâmina arterial no substrato PAA a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas.
No dia seguinte, usando uma agulha dobrada, levante cuidadosamente a lamínula e remova-a da folha arterial com uma pinça. Remova o meio do poço e do tecido circundante usando uma sucção a vácuo sem tocar no tecido, adicione uma gota de 10 microlitros de mistura de gel de colágeno tipo 1 em cada folha arterial. Deixe o gel polimerizar por uma hora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.
Após a incubação, adicione suavemente um mililitro de meio de ECG pré-aquecido a cada poço. Transfira a placa para uma incubadora a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono por 24 horas. O aumento da eficiência de fixação das folhas arteriais foi observado quando uma lamínula não tratada de 13 milímetros foi usada, minimizando as forças brutas durante sua remoção.
Após 24 horas de cultura da artéria carótida suína no sistema 2.5D, verifique se há angiogênese germinada. Se for observada angiogênese germinada, atualize o meio de ECG e coloque a placa de 12 poços no suporte do estágio dentro da caixa de incubação pré-aquecida a 37 graus Celsius do microscópio. Selecione a objetiva do microscópio com base nas necessidades de imagem.
Defina o tempo de exposição e ajuste o plano de foco usando a imagem de contraste de fase. Em seguida, adicione o canal fluorescente para obter imagens das esferas fluorescentes e defina o tempo de exposição novamente. Selecione várias regiões de interesse na amostra e ajuste o plano de foco para cada posição.
Defina o lapso de tempo de interesse selecionando um intervalo de tempo de 5 a 20 minutos e uma duração de 4 a 24 horas. Ligue o sistema de foco para manter um foco estável durante toda a imagem de lapso de tempo. Em seguida, para microscopia de força de tração, adicione 5% de SDS em água ultrapura ao poço e aguarde alguns minutos para que as células em crescimento se desprendam.
Adquira uma pilha Z de marcadores fluorescentes no substrato PAA para cada posição selecionada para obter um estado relaxado dos marcadores fluorescentes como imagem de referência. Usando códigos MATLAB personalizados, selecione imagens de lapso de tempo e de referência para processamento de imagem e defina parâmetros para análise. Alinhe e corte as imagens de lapso de tempo em relação à melhor imagem de referência Para uma análise precisa.
Meça o deslocamento de marcadores fluorescentes no hidrogel PAA realizando a assimetria vel da imagem de partículas entre a imagem de lapso de tempo e a imagem de referência. Configure a análise de assimetria de imagem para dividir as imagens em janelas de interrogação de 32 por 32 pixels com uma sobreposição de 0,5. Finalmente, calcule as forças de tração celular com base nas propriedades mecânicas do gel PAA.
A formação de brotos celulares foi observada nos modelos 2.5D e 3D da lâmina arterial suína, assemelhando-se a padrões angiogênicos, enquanto o modelo 2D não mostrou angiogênese de brotamento. A rigidez do substrato mole do hidrogel de PAA promoveu angiogênese arterial precoce em comparação com um substrato de PAA mais rígido, demonstrando efeitos de rigidez da matriz. A microscopia de força de tração revelou que os brotos celulares exibiam forças de tração nas saliências e forças de empurrão ao longo do eixo do broto, impulsionadas por células líderes e seguidoras.
