يركز بحثنا على تطبيق قياس الطيف الكتلي الكروماتوغرافيا في مجال الحمض النووي وبروتين الببتيد و CDT. يكمن التحدي في هذه التجربة في فصل مكونات متعددة من LNPs وتحديد المكونات ذات التركيزات المختلفة والقضايا المتبقية. تتمثل ميزة هذا البروتوكول في أنه يحقق فصلا جيدا ، ونطاقا خطيا واسعا ، وتحديدا حاليا ل LNPs بتكلفة منخفضة.
للبدء ، قم بإعداد كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ، أو نظام HPLC ، إلى جانب كاشف تشتت الضوء التبخيري. قم بتثبيت العمود الكروماتوغرافي باتباع اتجاه السهم على العمود. قم بتوصيل أحد طرفيه بمخرج جهاز أخذ العينات التلقائي، والآخر بمدخل كاشف تشتت الضوء التبخيري.
لتحضير المرحلة أ ، قم بقياس ونقل 1،387 ميكرولتر من ثلاثي إيثيل أمين بدقة وإذابتها في 1000 مل من الماء. تخلط جيدا وتضبط الرقم الهيدروجيني إلى سبعة باستخدام حمض الأسيتيك. لتحضير المرحلة ب ، قم بإذابة 1،387 ميكرولتر من ثلاثي إيثيل أمين في 1000 مل من الميثانول.
تخلط جيدا وتضبط الرقم الهيدروجيني إلى سبعة مع حمض الأسيتيك. ضع المرحلة أ والمرحلة ب في الدرج. قم بتشغيل برنامج LabSolutions وافتح نافذة التحليل في الوقت الفعلي.
انقر فوق ملف وحدد جديد لإنشاء ملف طريقة جديد ، وقم بتعديل وقت توقف الكروماتوغرافيا السائلة إلى 15 دقيقة ، وانقر فوق تطبيق على كل وقت الاستحواذ. ثم انقر فوق مضخة وقم بتعديل معلمات المضخة. حدد وضع التحليل كتدرج ثنائي للضغط العالي ، أو BGE ، واضبط معدل التدفق على مليلتر واحد في الدقيقة.
اضبط تركيز المضخة الأولية B على 80٪ قم بتعديل تدرج الطور المتحرك عند ثلاث دقائق إلى 80٪ في أربع دقائق إلى 85٪ من 5.5 إلى 12 دقيقة عند 100٪ وعند 12.1 دقيقة ، دع المضخة تعود إلى 80٪ الآن انقر فوق فرن العمود واضبط درجة حرارة الفرن على 55 درجة مئوية. ثم انقر فوق ELSD لتعديل درجة حرارة أنبوب الانجراف إلى 40 درجة مئوية وحفظ الطريقة. انقر فوق تنزيل وبدء التشغيل لبدء الأداة وتوازنها.
تزن بدقة 10 ملليغرام من كل مادة من المواد القياسية المكونة للجسيمات النانوية الدهنية الأربعة بشكل منفصل. قم بإذابة كل منها في ملليلتر واحد من الميثانول والدوامة حتى يذوب تماما للحصول على محاليل مخزون بتركيز 10 ملليغرام لكل مليلتر لكل مكون. باستخدام ماصة ، انقل بدقة 100 ميكرولتر من كل محلول مخزون إلى قارورة عينة.
أضف 600 ميكرولتر من الميثانول واخلطه جيدا لتحضير محلول وسيط مختلط بتركيز 1000 ميكروغرام لكل ملليلتر. الآن ، قم بنقل 20 ميكرولترا بدقة من كل محلول مخزون إلى قارورة عينة. أضف 920 ميكرولتر من الميثانول واخلطها جيدا لتحضير محلول وسيط مختلط ، اثنان بتركيز 200 ميكروغرام لكل ملليلتر.
تحضير سلسلة من المحاليل القياسية بتركيزات مختلفة عن طريق التخفيف التسلسلي. بعد ذلك ، باستخدام ماصة ، انقل بدقة 100 ميكرولتر من العينة إلى قارورة عينة. ثم أضف 900 ميكرولتر من الميثانول واخلطها جيدا لضمان تخفيف الجسيمات النانوية الدهنية بمقدار عشرة أضعاف وتفكيكها عن عقار الحمض النووي.
ضع المحاليل القياسية ومحاليل العينات في جهاز أخذ العينات التلقائي للكروماتوجراف السائل. انقر فوق دفعة الوقت الفعلي في شريط أدوات المساعد في نافذة التحليل في الوقت الفعلي. بعد ذلك، انقر فوق جديد في القائمة ملف لإنشاء جدول دفعي جديد.
في جدول الدفعات، أدخل رقم القارورة واسم الدرج وملف البيانات وحجم الحقن للحلول القياسية والعينة. حدد ملف الطريقة المحفوظة وانقر فوق حفظ الملف الدفعي في القائمة ملف. انتظر حتى يصبح ضغط الكروماتوجراف السائل وخط الأساس للكروماتوجرام مستقرين.
ثم انقر فوق بدء دفعة في الوقت الفعلي في شريط أدوات المساعد لبدء الحصول على البيانات. لتحليل البيانات، افتح نافذة متصفح برنامج LabSolutions. اسحب بيانات الحل القياسية إلى طريقة عرض النتائج الكمية لإنشاء منحنى معايرة.
قم بتعديل معلمات معالجة البيانات بالنقر فوق تحرير في عرض الأساليب. في نافذة معلمات التكامل، قم بتغيير خوارزمية التكامل إلى I-PeakFinder وقم بتعيين نوع الخط الأساسي إلى Base إلى Base. بعد ذلك ، في معلمات التعريف ، قم بتغيير طريقة التعريف إلى النطاق واضبط النطاق الترددي الافتراضي على 0.1 دقيقة.
لتعديل المعلمات الكمية ، قم بتغيير الطريقة الكمية إلى معيار خارجي. اضبط عدد مستويات المعايرة على سبعة. ثم حدد نوع منحنى المعايرة بشكل كبير وقم بتعديل الإعدادات المركبة.
أدخل الأسماء وتركيزات المحلول القياسية لمكونات الجسيمات النانوية الدهنية الأربعة. انقر نقرا مزدوجا فوق قمة الذروة لتحديث أوقات الاستبقاء. انقر فوق عرض لإكمال تعديل معلمات معالجة البيانات.
الآن ، قم بتعديل نوع العينة في طريقة عرض النتائج الكمية إلى نقطة الحساب القياسية. اضبط مستويات المحلول القياسي من واحد إلى سبعة حسب التركيزات. بمجرد إنشاء منحنيات المعايرة، انقر فوق ملف في شريط القائمة وحفظ ملف الأسلوب.
اسحب بيانات العينة إلى عرض النتائج الكمية لنافذة المتصفح. لاحظ نتائج التركيز المعروضة لمكونات الجسيمات النانوية الدهنية الأربعة في العينات. حقق تحليل المحلول القياسي LNP فصلا أساسيا بدرجة فصل أكبر من 1.5 للمكونات الأربعة ، ولم يلاحظ أي بقايا في المحاليل القياسية عالية التركيز.
أظهر منحنى المعايرة للمكونات الأربعة معاملات ارتباط تتجاوز 0.999 ضمن نطاق تركيز يتراوح بين خمسة و250 ميكروغرام لكل مليلتر ، مما يدل على خطية ممتازة. أظهرت الطريقة قابلية عالية للتكرار ، مع انحراف معياري نسبي لوقت الاحتفاظ أقل من 0.1٪ وانحراف معياري نسبي لمنطقة الذروة أقل من 2٪ بناء على ستة حقن متكررة من 10 ميكروغرام لكل مليلتر محلول قياسي. أظهر تحليل عينات LNP الفعلية المخففة 10 مرات بالميثانول تركيزات مكونات تتراوح من 150 ميكروغرام لكل مليلتر إلى 1 500 ميكروغرام لكل مليلتر ، مما يحقق فصلا وحساسية عاليا باستمرار عبر العديد من الشركات المصنعة.
