Наши исследования сосредоточены на применении хромато-масс-спектрометрии в области нуклеиновых кислот, пептидных белков и CDT. Сложность данного эксперимента заключается в разделении нескольких компонентов LNP и определении компонентов со значительными различиями в концентрациях и остаточных значениях. Преимущество этого протокола заключается в том, что он обеспечивает хорошее разделение, широкий линейный диапазон и определение тока LNP при низких затратах.
Для начала настройте высокопроизводительную систему жидкостной хроматографии, или ВЭЖХ, в сочетании с детектором испарительного рассеяния света. Установите хроматографическую колонку, следуя направлению стрелки на колонке. Подключите один конец к выходу автосамплера, а другой — к входу детектора испарительного рассеяния.
Для приготовления фазы А необходимо точно отмерить и перенести 1 387 микролитров триэтиламина и растворить его в 1000 миллилитрах воды. Хорошо перемешайте и отрегулируйте pH до семи с помощью уксусной кислоты. Для приготовления фазы В растворите 1 387 микролитров триэтиламина в 1000 миллилитров метанола.
Тщательно перемешайте и отрегулируйте pH до семи с уксусной кислотой. Поместите фазу А и фазу Б в лоток. Запустите программное обеспечение LabSolutions и откройте окно анализа в реальном времени.
Нажмите «Файл» и выберите «Создать», чтобы создать новый файл метода, измените время остановки жидкостной хроматографии на 15 минут и нажмите «Применить ко всему времени сбора». Затем нажмите «Насос» и измените параметры насоса. Выберите режим анализа как бинарный градиент высокого давления или BGE и установите скорость потока на уровне одного миллилитра в минуту.
Установите начальную концентрацию B в насосе на 80%Измените градиент подвижной фазы через три минуты до 80%через четыре минуты до 85%От 5,5 до 12 минут при 100%и через 12,1 минуты дайте насосу вернуться к 80%Теперь нажмите на «Колонная печь» и установите температуру духовки на 55 градусов Цельсия. Затем нажмите на ELSD, чтобы изменить температуру дрейфовой трубки до 40 градусов Цельсия и сохранить метод. Нажмите «Загрузить и запустить», чтобы запустить и уравновесить инструмент.
Точно весят по 10 мг каждого из четырех липидных наночастиц стандартного компонента вещества отдельно. Растворите каждый в одном миллилитре метанола и вортекса до полного растворения до получения стоковых растворов с концентрацией 10 миллиграмм на миллилитр для каждого компонента. С помощью пипетки аккуратно переложите по 100 микролитров каждого стокового раствора во флакон с образцом.
Добавьте 600 микролитров метанола и тщательно перемешайте, чтобы приготовить смешанный промежуточный раствор с концентрацией 1000 микрограмм на миллилитр. Теперь аккуратно перелейте по 20 микролитров каждого стокового раствора во флакон с образцом. Добавьте 920 микролитров метанола и тщательно перемешайте для приготовления смешанного промежуточного раствора двух с концентрацией 200 микрограмм на миллилитр.
Приготовьте серию стандартных растворов в различных концентрациях путем последовательного разведения. Далее с помощью пипетки аккуратно переложите 100 микролитров образца во флакон с образцом. Затем добавьте 900 микролитров метанола и хорошо перемешайте, чтобы обеспечить десятикратное разведение липидных наночастиц и их диссоциацию от препарата нуклеиновой кислоты.
Поместите стандартные растворы и образцы растворов в автоподатчик жидкостного хроматографа. Нажмите на пакет в реальном времени на панели инструментов помощника в окне анализа в реальном времени. Затем нажмите кнопку Создать в меню Файл, чтобы создать новую пакетную таблицу.
В таблице партий введите номер флакона, название лотка, файл данных и объем впрыска стандартного раствора и образца. Выберите сохраненный файл метода и нажмите кнопку Сохранить пакетный файл в меню Файл. Подождите, пока давление жидкостного хроматографа и базовый уровень хроматограммы не стабилизируются.
Затем нажмите на кнопку «Начать пакет в реальном времени» на панели инструментов помощника, чтобы начать сбор данных. Для анализа данных откройте окно браузера программного обеспечения LabSolutions. Перетащите данные стандартного решения в представление количественных результатов, чтобы создать калибровочную кривую.
Измените параметры обработки данных, нажав на кнопку Редактировать в окне метода. В окне параметров интеграции измените алгоритм интеграции на I-PeakFinder и установите тип базовой линии на Base to Base. Затем в параметрах идентификации измените метод идентификации на band и установите пропускную способность по умолчанию равной 0,1 минуты.
Чтобы изменить количественные параметры, измените количественный метод на внешний стандартный. Установите количество уровней калибровки равным семи. Затем выберите тип калибровочной кривой как экспоненциальный и измените настройки состава.
Введите названия и стандартные концентрации растворов четырех компонентов липидных наночастиц. Дважды щелкните по вершине пика, чтобы обновить время хранения. Нажмите кнопку Просмотр, чтобы завершить изменение параметров обработки данных.
Теперь измените тип выборки в виде количественных результатов на стандартную точку расчета. Установите уровни стандартного раствора от одного до семи в зависимости от концентраций. После того, как калибровочные кривые будут установлены, нажмите «Файл» в строке меню и «Сохранить файл метода».
Перетащите образец данных в представление количественных результатов в окне браузера. Наблюдайте за отображаемыми результатами концентрации четырех компонентов липидных наночастиц в образцах. При анализе стандартных растворов LNP было достигнуто исходное разделение со степенью разделения более 1,5 для четырех компонентов, и в стандартных растворах с высокой концентрацией не наблюдалось остатков.
Калибровочная кривая для четырех компонентов показала коэффициенты корреляции, превышающие 0,999 в диапазоне концентраций от пяти до 250 микрограммов на миллилитр, что указывает на превосходную линейность. Метод показал высокую воспроизводимость, с относительным стандартным отклонением для времени удержания менее 0,1% и относительным стандартным отклонением для пиковой площади менее 2% на основе шести повторных инъекций по 10 мкг на миллилитр стандартного раствора. Анализ реальных образцов LNP, разбавленных метанолом в 10 раз, показал концентрацию компонентов в диапазоне от 150 микрограммов на миллилитр до 1 500 микрограммов на миллилитр, что обеспечивает стабильно высокую сепарацию и чувствительность у многих производителей.
