우리의 연구는 핵산, 펩타이드 단백질 및 CDT 분야에서 크로마토그래피 질량 분석법의 응용에 중점을 둡니다. 이 실험의 과제는 LNP의 여러 성분을 분리하고 농도가 크게 다르고 잔류 문제가 있는 성분을 측정하는 데 있습니다. 이 프로토콜의 장점은 저렴한 비용으로 우수한 분리, 넓은 선형 범위 및 LNP의 전류 측정을 달성한다는 것입니다.
먼저 고성능 액체 크로마토그래피 또는 HPLC 시스템을 증발 광 산란 검출기와 함께 설정합니다. 컬럼의 화살표 방향을 따라 크로마토그래피 컬럼을 설치합니다. 한쪽 끝을 자동 시료 주입기 배출구에 연결하고 다른 쪽 끝을 증발 광 산란 검출기 입구에 연결합니다.
A상을 준비하려면 1, 387마이크로리터의 트리에틸아민을 정확하게 측정하고 전달하여 1000밀리리터의 물에 용해시킵니다. 잘 섞고 아세트산을 사용하여 pH를 7로 조정합니다. B 단계를 준비하려면 1000 밀리리터의 메탄올에 1, 387 마이크로 리터의 트리 에틸 아민을 용해시킵니다.
철저히 섞고 아세트산으로 pH를 7로 조정합니다. 트레이에 A상과 B상을 놓습니다. LabSolutions 소프트웨어를 실행하고 실시간 분석 창을 엽니다.
File(파일)을 클릭하고 New(새로 만들기)를 선택하여 새 분석법(Method) 파일을 생성하고, 액체 크로마토그래피 중지 시간을 15분으로 수정한 다음 Apply to All acquisition time(모든 수집 시간에 적용)을 클릭합니다. 그런 다음 펌프를 클릭하고 펌프 매개변수를 수정합니다. 분석 모드를 이진 고압 구배(BGE)로 선택하고 유속을 분당 1밀리리터로 설정합니다.
초기 펌프 B 농도를 80%로 설정 3분에서 80%로 이동상 구배를 4분에서 85%로 수정100%에서 5.5분에서 12분으로, 12.1분에서 펌프를 80%로 되돌리십시오.이제 컬럼 오븐을 클릭하고 오븐 온도를 섭씨 55도로 설정합니다. 그런 다음 ELSD를 클릭하여 드리프트 튜브 온도를 섭씨 40도로 수정하고 방법을 저장합니다. Download(다운로드)를 클릭하고 기기를 시작하고 평형을 맞추기 위해 시작합니다.
4가지 지질 나노입자 성분 표준 물질 각각을 10mg씩 따로 정확하게 계량합니다. 완전히 용해될 때까지 1밀리리터의 메탄올과 와류에 각각을 용해시켜 각 성분에 대해 밀리리터당 10밀리그램 농도의 원액을 얻습니다. 피펫을 사용하여 각 원액 100마이크로리터를 샘플 바이알로 정확하게 옮깁니다.
600 마이크로 리터의 메탄올을 넣고 완전히 혼합하여 밀리리터 당 1000 마이크로 그램 농도의 혼합 중간 용액을 준비합니다. 이제 20마이크로리터의 각 원액을 샘플 바이알에 정확하게 옮길 수 있습니다. 920 마이크로 리터의 메탄올을 첨가하고 완전히 혼합하여 밀리리터 당 200 마이크로 그램의 농도를 가진 혼합 중간 용액 2를 준비합니다.
연속 희석을 통해 다양한 농도의 일련의 표준 용액을 준비합니다. 다음으로, 피펫을 사용하여 100마이크로리터의 시료를 시료 바이알에 정확하게 전달합니다. 그런 다음 900마이크로리터의 메탄올을 첨가하고 잘 혼합하여 지질 나노 입자를 10배 희석하고 핵산 약물에서 해리합니다.
표준 용액과 시료 용액을 액체 크로마토그래프의 자동시료주입기에 넣습니다. 실시간 분석 창의 보조 도구 모음에서 실시간 배치를 클릭합니다. 그런 다음 파일 메뉴에서 새로 만들기를 클릭하여 새 배치 테이블을 만듭니다.
배치 테이블에서 바이알 번호, 트레이 이름, 데이터 파일, 표준 및 샘플 용액의 주입 부피를 입력합니다. 저장된 메소드 파일을 선택하고 파일 메뉴에서 배치 파일 저장을 클릭합니다. 액체 크로마토그래프 압력과 크로마토그램의 기준선이 안정될 때까지 기다립니다.
그런 다음 어시스턴트 도구 모음에서 실시간 배치 시작을 클릭하여 데이터 수집을 시작합니다. 데이터 분석을 위해 LabSolutions 소프트웨어의 브라우저 창을 엽니다. 표준 용액 데이터를 정량적 결과 보기로 끌어 검량선을 설정합니다.
method view에서 Edit(편집)를 클릭하여 데이터 처리 매개변수를 수정합니다. 통합 매개 변수 창에서 통합 알고리즘을 I-PeakFinder로 변경하고 기준선 유형을 Base에서 Base로 설정합니다. 그런 다음 식별 매개변수에서 식별 방법을 대역으로 변경하고 기본 대역폭을 0.1분으로 설정합니다.
정량적 매개변수를 수정하려면 정량적 방법을 외부 표준물질로 변경합니다. 보정 수준 수를 7로 설정합니다. 그런 다음 보정 곡선 유형을 기하급수적으로 선택하고 복합 설정을 수정합니다.
4가지 지질 나노 입자 성분의 이름과 표준 용액 농도를 입력합니다. peak apex를 두 번 클릭하여 보존 시간을 업데이트합니다. 보기를 클릭하여 데이터 처리 매개 변수의 수정을 완료합니다.
이제 정량적 결과 보기에서 샘플 유형을 표준 계산 포인트로 수정합니다. 농도에 따라 표준 용액의 수준을 1에서 7까지 설정합니다. 검량 곡선이 설정되면 메뉴 표시줄에서 File(파일)을 클릭하고 Method 파일을 저장합니다.
샘플 데이터를 브라우저 창의 정량적 결과 보기로 드래그합니다. 샘플에서 4가지 지질 나노 입자 성분의 표시된 농도 결과를 관찰합니다. LNP 표준 용액 분석은 4가지 성분에 대해 1.5 이상의 분리 정도를 가진 기준선 분리를 달성했으며, 고농도 표준 용액에서는 잔류물이 관찰되지 않았습니다.
4개 성분에 대한 검량선은 밀리리터당 5 - 250마이크로그램의 농도 범위 내에서 0.999를 초과하는 상관 계수를 나타내어 우수한 선형성을 나타냅니다. 이 방법은 0.1% 미만의 머무름 시간에 대한 상대 표준 편차와 2% 미만의 피크 면적에 대한 상대 표준 편차로 밀리리터당 10마이크로그램의 표준 용액을 6회 반복 주입하여 높은 재현성을 보여주었습니다. 메탄올로 10배 희석된 실제 LNP 샘플을 분석한 결과, 성분 농도가 밀리리터당 150마이크로그램에서 밀리리터당 1, 500마이크로그램 범위로 나타났으며, 이는 여러 제조업체에서 일관되게 높은 분리 및 감도를 달성했습니다.
