私たちの研究は、核酸、ペプチドタンパク質、およびCDTの分野におけるクロマトグラフィー質量分析の応用に焦点を当てています。この実験の課題は、LNPの複数の成分を分離し、濃度が大きく異なる成分と残留問題のある成分を決定することにあります。このプロトコルの利点は、良好な分離、広い線形範囲、およびLNPの電流測定を低コストで実現できることです。
まず、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)システムと蒸発光散乱検出器を組み合わせてセットアップします。クロマトグラフィーカラムをカラムの矢印の方向に取り付けます。一方の端をオートサンプラーの出口に接続し、もう一方の端を蒸発光散乱検出器の入口に接続します。
フェーズAを調製するには、1, 387マイクロリットルのトリエチルアミンを正確に測定して移し、それを1000ミリリットルの水に溶解します。よく混ぜて、酢酸を使用してpHを7に調整します。フェーズBを調製するには、1,387マイクロリットルのトリエチルアミンを1000ミリリットルのメタノールに溶解します。
よく混ぜ合わせ、酢酸でpHを7に調整します。フェーズAとフェーズBをトレイに置きます。LabSolutionsソフトウェアを起動し、リアルタイム分析ウィンドウを開きます。
「File」をクリックし、「New」を選択して新しいメソッドファイルを作成し、液体クロマトグラフィーの停止時間を 15 分に変更して、「Apply to All acquisition time」をクリックします。次に、[ポンプ]をクリックして、ポンプパラメータを変更します。解析モードとしてバイナリ高圧勾配(BGE)を選択し、流量を1分あたり1ミリリットルに設定します。
ポンプBの初期濃度を80%に設定します移動相のグラジエントを3分で80%に変更し、4分で85%に変更し、100%で5.5分から12分、12.1分でポンプを80%に戻します次に、カラムオーブンをクリックしてオーブンの温度を摂氏55度に設定します。次に、[ELSD]をクリックしてドリフトチューブの温度を摂氏40度に変更し、メソッドを保存します。「ダウンロードして起動」をクリックして、装置を起動し、平衡化します。
脂質ナノ粒子成分標準物質4種をそれぞれ10ミリグラムずつ精密に計量します。それぞれを1ミリリットルのメタノールに溶解し、完全に溶解するまでボルテックスして、各成分に対して1ミリグラム/ミリリットルの濃度のストック溶液を得る。ピペットを使用して、各ストック溶液の100マイクロリットルをサンプルバイアルに正確に移します。
600マイクロリットルのメタノールを加え、十分に混合して、1ミリリットルあたり1000マイクログラムの濃度の混合中間溶液を調製します。次に、各ストック溶液の20マイクロリットルをサンプルバイアルに正確に移します。920マイクロリットルのメタノールを加え、十分に混合して、200マイクログラム/ミリリットルの濃度の混合中間溶液2を調製します。
一連の標準溶液を異なる濃度で段階希釈して調製します。次に、ピペットを使用して、サンプルの100マイクロリットルをサンプルバイアルに正確に移します。次に、900マイクロリットルのメタノールを加えてよく混合し、脂質ナノ粒子が10倍に希釈され、それらが核酸薬物から解離することを確認します。
標準溶液とサンプル溶液を液体クロマトグラフのオートサンプラーに入れます。リアルタイム解析ウィンドウのアシスタントツールバーでリアルタイムバッチをクリックします。次に、[ファイル] メニューの [新規] をクリックして、新しいバッチ テーブルを作成します。
バッチテーブルに、バイアル番号、トレイ名、データファイル、標準溶液とサンプル溶液の注入量を入力します。保存したメソッドファイルを選択し、[ファイル]メニューの[バッチファイルの保存]をクリックします。液体クロマトグラフの圧力とクロマトグラムのベースラインが安定するまで待ちます。
次に、アシスタントツールバーの[リアルタイムバッチの開始]をクリックして、データ取得を開始します。データ分析を行うには、LabSolutionsソフトウェアのブラウザウィンドウを開きます。標準溶液データを定量結果ビューにドラッグして、検量線を確立します。
データ処理パラメータを変更するには、メソッドビューでEditをクリックします。積分パラメータウィンドウで、積分アルゴリズムをI-PeakFinderに変更し、ベースラインタイプをBaseからBaseに設定します。次に、識別パラメーターで、識別方法をバンドに変更し、デフォルトの帯域幅を 0.1 分に設定します。
定量パラメータを変更するには、定量方法を外部標準に変更します。キャリブレーション レベルの数を 7 に設定します。次に、検量線タイプを指数関数的に選択し、化合物の設定を変更します。
脂質ナノ粒子の4成分の名称と標準溶液濃度を入力します。ピーク頂点をダブルクリックして、保持時間を更新します。「表示」をクリックして、データ処理パラメーターの変更を完了します。
次に、定量的結果ビューのサンプルタイプを標準計算ポイントに変更します。濃度に応じて、標準溶液のレベルを1から7に設定します。検量線が確立されたら、メニューバーのFileをクリックし、メソッドファイルを保存します。
サンプルデータをブラウザウィンドウの定量的結果ビューにドラッグします。サンプル中の4つの脂質ナノ粒子成分の濃度結果が表示されます。LNP 標準溶液分析では、4 つの成分について分離度が 1.5 を超えるベースライン分離が達成され、高濃度標準溶液では残留物は観察されませんでした。
4つの成分の検量線は、5〜250μg/ミリリットルの濃度範囲内で0.999を超える相関係数を示し、優れた直線性を示しました。この分析法は高い再現性を示し、10 μg/mL 標準溶液を 6 回繰り返し注入した場合、保持時間での相対標準偏差は 0.1% 未満、ピーク面積での相対標準偏差は 2% 未満でした。メタノールで10倍に希釈した実際のLNPサンプルの分析では、1ミリリットルあたり150マイクログラムからミリリットルあたり1,500マイクログラムの範囲の成分濃度が示され、複数のメーカー間で一貫して高い分離と感度が達成されました。
