Unsere Forschung konzentriert sich auf die Anwendung der chromatographischen Massenspektrometrie im Bereich der Nukleinsäuren, Peptidproteine und CDT. Die Herausforderung dieses Experiments liegt in der Trennung mehrerer Komponenten von LNPs und der Bestimmung von Komponenten mit signifikant unterschiedlichen Konzentrationen und Restproblemen. Der Vorteil dieses Protokolls besteht darin, dass es eine gute Trennung, einen großen linearen Bereich und eine Strombestimmung von LNPs zu geringen Kosten erreicht.
Richten Sie zunächst ein Hochleistungsflüssigkeitschromatographie- oder HPLC-System ein, das mit einem Verdunstungslichtstreudetektor gekoppelt ist. Installieren Sie die chromatographische Säule in Pfeilrichtung auf der Säule. Verbinden Sie ein Ende mit dem Auslass des Autosamplers und das andere mit dem Einlass des Verdunstungslichtstreudetektors.
Zur Vorbereitung von Phase A messen und übertragen Sie 1.387 Mikroliter Triethylamin genau und lösen Sie es in 1000 Millilitern Wasser auf. Gut mischen und den pH-Wert mit Essigsäure auf sieben einstellen. Zur Vorbereitung von Phase B lösen Sie 1.387 Mikroliter Triethylamin in 1000 Millilitern Methanol.
Gründlich mischen und den pH-Wert mit Essigsäure auf sieben einstellen. Legen Sie Phase A und Phase B in das Fach. Starten Sie die LabSolutions-Software und öffnen Sie das Echtzeit-Analysefenster.
Klicken Sie auf Datei und wählen Sie Neu, um eine neue Methodendatei zu erstellen, ändern Sie die Stoppzeit der Flüssigkeitschromatographie auf 15 Minuten und klicken Sie auf Auf alle Erfassungszeit anwenden. Klicken Sie dann auf Pumpe und ändern Sie die Pumpenparameter. Wählen Sie den Analysemodus als binärer Hochdruckgradient (BGE) und stellen Sie die Durchflussrate auf einen Milliliter pro Minute ein.
Stellen Sie die Anfangskonzentration der Pumpe B auf 80 % einÄndern Sie den Gradienten der mobilen Phase bei drei Minuten auf 80 %, bei vier Minuten auf 85 % von 5,5 auf 12 Minuten bei 100 % und bei 12,1 Minuten, lassen Sie die Pumpe auf 80 % zurückgestellt werdenKlicken Sie nun auf Säulenofen und stellen Sie die Ofentemperatur auf 55 Grad Celsius ein. Klicken Sie dann auf ELSD, um die Temperatur des Driftrohrs auf 40 Grad Celsius zu ändern und die Methode zu speichern. Klicken Sie auf Herunterladen und starten, um das Instrument zu starten und auszugleichen.
Wiegen Sie 10 Milligramm jeder der vier Standardsubstanzen der Lipid-Nanopartikel-Komponenten separat ab. Jedes wird in einem Milliliter Methanol aufgelöst und vortext, bis es vollständig aufgelöst ist, um Stammlösungen mit einer Konzentration von 10 Milligramm pro Milliliter für jede Komponente zu erhalten. Übertragen Sie mit einer Pipette 100 Mikroliter jeder Stammlösung genau in ein Probenfläschchen.
Fügen Sie 600 Mikroliter Methanol hinzu und mischen Sie gründlich, um eine gemischte Zwischenlösung mit einer Konzentration von 1000 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen. Übertragen Sie nun genau 20 Mikroliter jeder Stammlösung in ein Probengefäß. 920 Mikroliter Methanol zugeben und gründlich mischen, um eine gemischte Zwischenlösung zwei mit einer Konzentration von 200 Mikrogramm pro Milliliter herzustellen.
Bereiten Sie eine Reihe von Standardlösungen in unterschiedlichen Konzentrationen durch serielle Verdünnung her. Übertragen Sie anschließend mit einer Pipette 100 Mikroliter der Probe genau in ein Probenfläschchen. Fügen Sie dann 900 Mikroliter Methanol hinzu und mischen Sie gut, um eine zehnfache Verdünnung der Lipid-Nanopartikel und deren Dissoziation vom Nukleinsäure-Medikament zu gewährleisten.
Geben Sie die Standardlösungen und Probenlösungen in den Autosampler des Flüssigkeitschromatographen. Klicken Sie auf Echtzeit-Batch in der Assistenten-Symbolleiste des Echtzeit-Analysefensters. Klicken Sie anschließend im Menü Datei auf Neu, um eine neue Stapeltabelle zu erstellen.
Geben Sie in der Chargentabelle die Fläschchennummer, den Namen des Tabletts, die Datendatei und das Injektionsvolumen der Standard- und Probenlösung ein. Wählen Sie die gespeicherte Methodendatei aus und klicken Sie im Menü Datei auf Batch-Datei speichern. Warten Sie, bis der Flüssigkeitschromatographendruck und die Basislinie des Chromatogramms stabil sind.
Klicken Sie dann in der Symbolleiste des Assistenten auf Echtzeit-Batch starten, um die Datenerfassung zu starten. Um die Daten zu analysieren, öffnen Sie das Browserfenster der LabSolutions-Software. Ziehen Sie die Daten der Standardlösung in die Ansicht "Quantitative Ergebnisse", um eine Kalibrierungskurve zu erstellen.
Ändern Sie die Parameter für die Datenverarbeitung, indem Sie in der Methodenansicht auf Bearbeiten klicken. Ändern Sie im Fenster mit den Integrationsparametern den Integrationsalgorithmus in I-PeakFinder und legen Sie den Baseline-Typ auf Base to Base fest. Ändern Sie dann in den Identifikationsparametern die Identifikationsmethode in band, und legen Sie die Standardbandbreite auf 0,1 Minuten fest.
Um die quantitativen Parameter zu ändern, ändern Sie die quantitative Methode in einen externen Standard. Legen Sie die Anzahl der Kalibrierungsstufen auf sieben fest. Wählen Sie dann den Kalibrierkurventyp als exponentiell aus und ändern Sie die Verbundeinstellungen.
Geben Sie die Namen und Standardlösungskonzentrationen der vier Lipid-Nanopartikelkomponenten ein. Doppelklicken Sie auf den Spitzenpunkt, um die Aufbewahrungszeiten zu aktualisieren. Klicken Sie auf Ansicht, um die Änderung der Datenverarbeitungsparameter abzuschließen.
Ändern Sie nun den Stichprobentyp in der Ansicht "Quantitative Ergebnisse" in den Standardberechnungspunkt. Stellen Sie die Werte der Standardlösung entsprechend den Konzentrationen von eins bis sieben ein. Sobald die Kalibrierungskurven erstellt sind, klicken Sie in der Menüleiste auf Datei und speichern Sie die Methodendatei.
Ziehen Sie die Beispieldaten in die quantitative Ergebnisansicht des Browserfensters. Beobachten Sie die angezeigten Konzentrationsergebnisse der vier Lipid-Nanopartikel-Komponenten in den Proben. Die LNP-Standardlösungsanalyse erreichte eine Basistrennung mit einem Trenngrad von mehr als 1,5 für die vier Komponenten, und in hochkonzentrierten Standardlösungen wurden keine Rückstände beobachtet.
Die Kalibrierkurve für die vier Komponenten wies Korrelationskoeffizienten von über 0,999 im Konzentrationsbereich von fünf bis 250 Mikrogramm pro Milliliter auf, was auf eine hervorragende Linearität hinweist. Die Methode zeigte eine hohe Reproduzierbarkeit mit einer relativen Standardabweichung für eine Retentionszeit von weniger als 0,1 % und einer relativen Standardabweichung für den Peakbereich von weniger als 2 %, basierend auf sechs wiederholten Injektionen von 10 Mikrogramm pro Milliliter Standardlösung. Die Analyse von tatsächlichen LNP-Proben, die 10-mal mit Methanol verdünnt wurden, zeigte Komponentenkonzentrationen von 150 Mikrogramm pro Milliliter bis 1.500 Mikrogramm pro Milliliter, wodurch eine gleichbleibend hohe Trennung und Empfindlichkeit über mehrere Hersteller hinweg erreicht wurde.
