平衡结合常数 （K_b） 量化蛋白质-配体相互作用的强度。当反应处于平衡状态时，K_b 可以按以下方式计算:

其中 P 和 L 分别是未结合的蛋白质和配体，PL 是蛋白质-配体复合物。

由于结合配体的量也与配体结合的速率有关，因此实验还可以通过使用以下比率检查蛋白质-配体结合 （k_on） 和解离 （k_off） 的速率来确定 K_b:

因此，使用两类结合测定来确定平衡结合常数 - 测量平衡浓度的结合测定和测量反应动力学的结合测定。如果，反应在测量时必须处于平衡状态。

测定平衡浓度的方法取决于所需的灵敏度和信号检测的难易程度。由于这些原因，光谱分析使用最广泛。在这些实验中，反应产生反应物或产物在给定波长下的吸光度变化，可通过紫外-可见分光光度计检测。或者，反应物或产物可以用荧光探针标记，或者可能含有内在荧光团。然后，可以从荧光的变化中测量反应进程。这些分析是通过改变一种反应物的浓度而实验的其余部分保持不变来进行的。然后，可以使用各种曲线拟合方法对结果进行绘图和分析。

还使用各种生化和光谱技术研究了蛋白质和配体之间的相互作用。使用 X 射线晶体学和 NMR 波谱进行结构分析，有助于通过分子模拟预测蛋白质-配体相互作用。理论和计算方法（例如蛋白质-配体对接研究）被广泛用于表征小分子配体（包括候选药物）的位置和相互作用。计算机辅助药物设计是一种快速且低成本的替代方案，可加快传统试错药物测试的步伐。