La constante de unión de equilibrio (K_b) cuantifica la fuerza de una interacción proteína-ligando. K_b se puede calcular de la siguiente manera cuando la reacción está en equilibrio:

donde P y L son la proteína no unida y el ligando, respectivamente, y PL es el complejo proteína-ligando.

Como la cantidad de ligando unido también está relacionada con la velocidad de unión del ligando, los experimentos también pueden determinar K_b examinando las tasas de asociación proteína-ligando (k_on) y disociación (k_off) utilizando la siguiente relación:

Por lo tanto, se utilizan dos categorías de ensayos de unión para determinar la constante de enlace de equilibrio: los que miden las concentraciones de equilibrio y los que miden la cinética de una reacción. En caso de que la reacción esté en equilibrio en el momento de la medición.

El método para determinar las concentraciones de equilibrio depende de la sensibilidad deseada y de la facilidad de detección de la señal. Por estas razones, los ensayos espectroscópicos son los más utilizados. En estos experimentos, la reacción produce un cambio en la absorbancia de un reactivo o un producto a una longitud de onda dada, detectable por un espectrofotómetro UV-Vis. Alternativamente, el reactivo o producto puede marcarse con una sonda fluorescente o puede contener un fluoróforo intrínseco. Luego, el progreso de la reacción se puede medir a partir del cambio en la fluorescencia. Estos ensayos se realizan variando las concentraciones de un reactivo mientras el resto del experimento se mantiene constante. Los resultados se pueden graficar y analizar con varios métodos de ajuste de curvas.

Las interacciones entre proteínas y ligandos también se estudian utilizando una variedad de técnicas bioquímicas y espectroscópicas. El análisis estructural, mediante cristalografía de rayos X y espectroscopia de RMN, ayuda a predecir las interacciones proteína-ligando a través de simulaciones moleculares. Los enfoques teóricos y computacionales, como los estudios de acoplamiento proteína-ligando, se utilizan ampliamente para caracterizar la posición y las interacciones de los ligandos de moléculas pequeñas, incluidos los candidatos a fármacos. El diseño de fármacos asistido por ordenador es una alternativa rápida y de bajo coste para acelerar el ritmo de las pruebas convencionales de ensayo y error.