A constante de ligação de equilíbrio (K_b) quantifica a força de uma interação proteína-ligando. K_b pode ser calculado da seguinte forma quando a reação está em equilíbrio:

onde P e L são a proteína não ligada e o ligando, respectivamente, e PL é o complexo proteína-ligando.

Como a quantidade de ligando ligado também está relacionada com a taxa de ligação, experiências também podem determinar K_b examinando as taxas de associação (k_on) e dissociação (k_off) de proteína-ligando usando a seguinte proporção:

Assim, duas categorias de ensaios de ligação são utilizadas para determinar a constante de ligação de equilíbrio – as que medem as concentrações em equilíbrio e as que medem a cinética de uma reacção. No caso, a reação deve estar em equilíbrio no momento da medição.

O método de determinação das concentrações de equilíbrio depende da sensibilidade desejada e da facilidade de deteção do sinal. Por estas razões, os ensaios espectroscópicos são mais amplamente utilizados. Nestas experiências, a reação produz uma alteração de absorvância de um reagente ou de um produto em um determinado comprimento de onda, detectável por um espectrofotómetro UV-Vis. Alternativamente, o reagente ou produto pode ser marcado com uma sonda fluorescente ou pode conter um fluoróforo intrínseco. Em seguida, o progresso da reação pode ser medido a partir da alteração da fluorescência. Estes ensaios são realizados variando as concentrações de um reagente, enquanto que a restante experiência é mantida constante. Os resultados podem então ser colocados em gráfico e analisados por vários métodos de ajuste de curvas.

Interações entre proteínas e ligandos também são estudadas utilizando uma variedade de técnicas bioquímicas e espectroscópicas. A análise estrutural, utilizando a cristalografia de raios X e a espectroscopia NMR, auxilia na previsão das interações proteína-ligando através de simulações moleculares. Abordagens teóricas e computacionais, como estudos de ligação proteína-ligando, são usadas extensivamente para caracterizar a posição e interações de moléculas pequenas de ligandos, incluindo candidatos a fármacos. O desenvolvimento de fármacos auxiliado por computador é uma alternativa rápida e de baixo custo para acelerar o ritmo da testagem de fármacos convencional de tentativa e erro.