牛痘病毒感染及病毒基因表达的时空分析：第1部分

摘要

协议牛痘感染的HeLa细胞和宿主和病毒基因的表达分析。

摘要

家庭

研究方案

第1部分：设置感染

1. HeLa细胞生长在烧瓶，等到约80％融合的细胞。
2. 准备足够的实验病毒的生长介质：含2％FBS的DMEM定期和不添加抗生素。
3. 感染可以进行原油库存的牛痘病毒与已知的滴度，或蔗糖纯化与一个已知滴度的病毒，如果你对宿主基因表达有关。
4. 如果您使用的是蔗糖纯化的病毒，请直接进入第2部分。
5. 如果您使用的是一个粗略的牛痘病毒的股票，只是之前的感染，超声一杯sonicator病毒等分的大多是冰的浴缸和一点点水。
   • 在20秒左右30W超声。
   • 涡管和重复的超声3次，加入更多的冰，如果需要保持与冰和冷冻包装的杯子。
   • 涡之间的每个超声一步。
   • 进入第2部分。
6. 另外，如果你不具备一个杯子sonicator，等体积混合的原油病毒库存和0.25mg/mL胰蛋白酶。
   • 涡大力。
   • 股票/胰蛋白酶在37℃水浴孵育病毒混合30分钟。
   • 涡在5-10分钟一班。
   • 进入第2部分。

第2部分：感染细胞

1. 计算病毒感染所需的感染复数（MOI）的单层颗粒的数量。通常情况下，高MOI（5和10之间），是用于感染timecourses。
2. 添加蔗糖纯化的病毒或胰酶消化原油病毒所需的金额，以37 ° C病毒的生长媒体和拌匀。您应该使用足够的介质，以刚好盖住烧瓶的底部。例如，10毫升的T - 175烧瓶媒体。
3. 从细胞中移除的媒体和室温PBS冲洗。
4. 添加到每个烧瓶中的病毒/病毒的生长介质。
   • 涡流轻轻倾斜板和37 ° C为1小时5％CO2培养箱。
   • 每15分钟倾斜和旋流板，传播病毒的统一，保持细胞的湿润。
   • 对于0hr/Mock时间点，只添加病毒的生长介质，添加没有病毒的。
5. 1小时的潜伏期后，取出含有病毒的媒体，并与室温PBS冲洗三次。
6. 添加到每个烧瓶中的病毒的生长介质的最高金额。例如，30毫升的T - 175烧瓶媒体。开始计数为0小时的时间点。

第3部分：收获细胞

1. 细胞在显微镜下检查，并注意任何细胞病变效应（CPE）。
2. 取出介质，并与30毫升室温PBS冲洗细胞。
3. 添加15毫升的胰蛋白酶的细胞和2 - 5分钟，在37 ° C。
4. 在显微镜下检查细胞脱落和挖掘烧瓶中，轻轻地打跑细胞。
5. 血清50 mL锥形管，用无菌吸管转移细胞。
6. 洗细胞生长介质等体积的容量瓶中，并添加媒体在锥形管的胰酶消化细胞。
7. 离心机在室温下5分钟的300 ×克细胞。
8. 取出细胞​​沉淀的胰蛋白酶/媒体。
9. 无论你所需的RNA提取试剂盒TRIzol试剂或细胞裂解液重悬细胞沉淀。
10. 如果你是用TRIzol，分为1毫升分装在1.5ml的标记Eppendorf管中，并冻结的样品在-80 ° C。
11. 重复所有的时间点，每一个时间点瓶收获。

第4部分：在TRIZOL RNA提取样品

1. 在这一点上，您的样品应悬浮于Trizol试剂，并准备进行处理。
2. 新增的Trizol每1毫升每管BCP相分离试剂200μL。您可能需要将样品转移到一个较大的管，如果你开始与大量的Trizol。
3. 涡或用力振摇，并在室温下孵育2-3分钟。
4. 离心12,000 15分钟XG的样本。
5. 水相转移到一个新的管。水相是在顶部的层次清晰。你应该收回大约为每毫升TRIZOL你开始600μL。
6. 做第二个酚/氯仿抽提，而不是口岸这次使用的氯仿每1 ml TRIZOL500μL，。
7. 涡或用力振摇，并在室温下孵育2-3分钟。
8. 离心12,000 15分钟XG的样本。
9. 水相转移到一个新的管。水相是在顶部的层次清晰。
10. 每个样品中添加20μg线性丙烯酰胺。线性丙烯酰胺作为载体，有助于沉淀的RNA。
11. 新增500＆MICRO;异丙醇大号，每1毫升的Trizol，你开始了与每个样品拌匀。
12. 样品在室温下孵育10分钟。
13. 离心机在一个最高速度为10-15分钟，离心。
14. 的RNA沉淀在试管底部可见。非常仔细，从管中移除上清液，使用真空吸引器，或手动移液器。请勿打扰的颗粒。
15. 1毫升70％的乙醇洗涤沉淀。
    • 加入1毫升70％的乙醇沉淀。
    • 以最快的速度离心14000克为5-7分钟。
    • 非常仔细，从管中删除乙醇，使用真空吸引器或手动移液器。检查，沉淀在试管底部可见。
    • 上清液。
16. 重复洗涤步骤。后取上清液丢弃，标记颗粒管。
17. 空气干燥颗粒不超过5分钟。不要overdry，或RNA的重组将难以！
18. 如果你想按照可选的DNA酶处理，以去除任何剩余的DNA样品，无核酸酶水悬浮颗粒在17μL。否则，重悬沉淀，无核酸酶水20μL，继续到步骤22。
19. （可选的DNA酶处理）使用Qiagen公司的无RNA酶的DNA酶设置，添加2μL缓冲区的RDD和1μL重组无RNase的悬浮RNA的DNA酶我。轻轻混匀。
20. （可选的DNA酶处理）37 ° 30分钟。
21. （可选的DNA酶处理）添加2μL2.5毫米EDTA和孵化，在65 ° C至5分钟灭活DNA酶。不要超过灭活时间或温度，更长的时间/温度较高，可能会导致RNA的降解。
22. 检查由分光光度计的RNA浓度。
23. RNA样品存放在-80 ° C
24. （可选的QC）使用安捷伦生物分析仪检查RNA的质量，或通过运行一个变性凝胶上的样品和检查的OD值。 （260nm和260/280的比例）

讨论

关键步骤

第1部分和2

有几个关键步骤设置同步的牛痘感染，小心病毒（或trypzinizing）超声，以分解病毒颗粒。牛痘是极易发生聚合，重要的是确保即使感染细胞的病毒颗粒的破坏。为了实现一个同步的感染，高MOI（大于2）应使用，以确保每一个细胞都感染。受感染和未受感染的细胞的混合物，会导致感染，多轮异构混合物的时间点，和异步的病毒与宿主转录...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIzol Reagent	Reagent	Invitrogen	15596-026	Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work.
BCP Phase Separation Reagent	Reagent	Molecular Research Center	BP151
RNase-Free DNase Set	Reagent	Qiagen	79254	DNase treatment is an optional step.