Infection virus de la vaccine et l'analyse temporelle de l'expression des gènes de virus: Partie 1

Résumé

Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux.

Résumé

La famille

Protocole

Partie 1: Mise en place de l'infection

1. Cultiver des cellules HeLa dans des flacons et attendre que les cellules sont d'environ 80% de confluence.
2. Préparez assez moyennes croissance virale de l'expérience: régulière DMEM avec 2% de FBS et sans antibiotiques ajoutés.
3. L'infection peut être réalisée soit avec un stock brut de virus de la vaccine avec un titre connu, ou saccharose virus purifié avec un titre connu, si vous êtes préoccupé par l'expression du gène hôte.
4. Si vous utilisez le virus du saccharose purifié, passez directement à la partie 2.
5. Si vous utilisez un stock de virus vaccine brut, juste avant l'infection, soniquer une aliquote du virus dans un sonicateur tasse avec un bain de glace et la plupart du temps un peu d'eau.
   • Soniquer à environ 30W pendant 20 secondes.
   • Vortexer le tube et répétez la sonication trois fois, en ajoutant plus de glace si nécessaire pour garder la tasse remplie de glace et de froid.
   • Vortex entre chaque étape de sonication.
   • Passez à la partie 2.
6. Alternativement, si vous ne possédez pas un sonicateur tasse, mélangez un volume égal du stock de virus brut et la trypsine 0.25mg/mL.
   • Vortex vigoureusement.
   • Incuber le stock de virus / trypsine mélanger dans un bain-marie à 37 ° C pendant 30 minutes.
   • Vortex à intervalles de 5-10 minutes.
   • Passez à la partie 2.

Partie 2: infecter les cellules

1. Calculer la quantité de particules virales nécessaires pour infecter la monocouche à la multiplicité désirée d'infection (MOI). Typiquement, un MOI élevé (entre 5 et 10) est utilisé pour timecourses infection.
2. Ajouter la quantité voulue de virus de saccharose purifié ou trypsinisées virus de brut à 37 ° C les milieux de croissance virale et bien mélanger. Vous devez utiliser les médias suffit pas de couvrir le fond de la fiole. Par exemple, 10 ml de médias pour un flacon T-175.
3. Retirez le support à partir des cellules et rincer à température ambiante PBS.
4. Ajouter le virus / media croissance virale dans chaque flacon.
   • Agiter doucement, assiettes d'inclinaison et incuber à 37 ° C dans un incubateur à 5% de CO2 pendant 1 heure.
   • Plaques Tilt et agiter toutes les 15 minutes pour la propagation du virus de façon uniforme et garder les cellules humides.
   • Pour un point de temps 0hr/Mock, ajouter le support de croissance virale uniquement, sans virus ajouté.
5. Après l'incubation de 1 heure, retirer le support contenant le virus, et rincer trois fois avec la température ambiante du PBS.
6. Ajouter le montant maximum du milieu de croissance virale dans chaque flacon. Par exemple, 30 ml de médias pour un flacon T-175. Commencez à compter ce que votre point 0 h de temps.

Partie 3: Récolte des cellules

1. Vérifiez les cellules sous un microscope et de noter tout effet cytopathogène (ECP).
2. Retirez le support et rincer les cellules avec 30 ml de la température ambiante du PBS.
3. Ajouter 15 ml de trypsine dans les cellules et incuber pendant 2-5min à 37 ° C.
4. Vérifiez sous le microscope pour le détachement des cellules et appuyez délicatement flacon pour déloger les cellules.
5. Transfert cellules avec une pipette stérile sérologique dans un tube conique de 50 ml.
6. Laver le ballon avec un volume égal de milieu de croissance cellulaire, et d'ajouter le support pour les cellules traitées à la trypsine dans le tube conique.
7. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante.
8. Retirez la trypsine / media à partir du culot cellulaire.
9. Reprendre le culot cellulaire soit réactif Trizol ou le tampon de lyse à partir de votre kit d'isolement désiré ARN.
10. Si vous utilisez TRIzol, diviser l'échantillon en aliquotes de 1 mL dans des tubes Eppendorf 1,5 ml étiquetés et congeler à -80 ° C.
11. Répétez l'opération pour tous les points du temps, un flacon de récolte par point de temps.

Partie 4: extraction d'ARN des échantillons dans TRIzol

1. À ce stade, vos échantillons doivent être remis en suspension dans du réactif Trizol et prêtes à être traitées.
2. Ajouter 200 ul de réactif PCA séparation de phase pour chaque 1 mL de Trizol dans chaque tube. Vous pouvez avoir besoin de transférer l'échantillon à un plus grand tube, si vous êtes débutant avec une grande quantité de TRIzol.
3. Vortex ou secouer vigoureusement et incuber à température ambiante pendant 2-3 minutes.
4. Centrifuger l'échantillon à 12 000 xg pendant 15 minutes.
5. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube. La phase aqueuse est la couche claire sur le dessus. Vous devriez être en récupérer environ 600μL pour chaque 1 ml de Trizol vous avez commencé avec.
6. Faites une deuxième extraction phénol / chloroforme, en utilisant cette fois 500μL de chloroforme pour 1 ml TRIzol, au lieu de la BCP.
7. Vortex ou secouer vigoureusement et incuber à température ambiante pendant 2-3 minutes.
8. Centrifuger l'échantillon à 12 000 xg pendant 15 minutes.
9. Transférer la phase aqueuse dans un nouveau tube. La phase aqueuse est la couche claire sur le dessus.
10. Ajouter 20 pg d'acrylamide linéaire pour chaque échantillon. L'acrylamide linéaire agit comme un transporteur et contribue à précipiter l'ARN.
11. Ajouter 500 & MiCRO; L d'isopropanol pour 1 ml de Trizol vous avez commencé avec à chaque échantillon et bien mélanger.
12. Incuber les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes.
13. Centrifuger dans une microcentrifugeuse à vitesse maximale pendant 10-15 minutes.
14. Le culot d'ARN sera visible au fond du tube. Très soigneusement, éliminer le surnageant du tube, soit avec un aspirateur, ou manuellement par pipette. Ne pas perturber le culot.
15. Laver le culot avec 1 ml d'éthanol à 70%.
    • Ajouter 1 ml d'éthanol à 70% au culot.
    • Centrifuger à vitesse maximale 14 000 g pendant 5-7 minutes.
    • Très soigneusement, éliminer l'éthanol à partir du tube, soit avec un aspirateur, ou manuellement par pipette. Vérifiez que la pastille est visible au fond du tube.
    • Jeter le surnageant.
16. Répéter l'étape de lavage. Après le surnageant est éliminé, marquer l'endroit où culot est sur le tube.
17. Air culot sec pour pas plus de 5 minutes. Ne pas trop sécher, ou l'ARN sera difficile à reconstituer!
18. Si vous souhaitez suivre le traitement optionnel DNase pour éliminer l'ADN restant de l'échantillon, resuspendre le culot dans 17μL d'eau sans nucléase. Sinon, resuspendre le culot dans 20 pi d'eau sans nucléase et continuer à l'étape 22.
19. (Facultatif traitement à la DNase) Utilisation du Qiagen RNase-free DNase jeu, ajoutez 2μL tampon et 1 microlitre RDD reconstitué sans RNase DNase I de l'ARN en suspension. Mélanger délicatement.
20. (Facultatif traitement à la DNase) Incuber à 37 ° C pendant 30 minutes.
21. (Facultatif traitement à la DNase) Ajouter 2μL de 2,5 mM d'EDTA et incuber à 65 ° C pendant 5 minutes pour inactiver la DNase. Ne pas dépasser le temps d'inactivation ou la température que plus les temps / températures élevées peut entraîner la dégradation de l'ARN.
22. Vérifiez la concentration en ARN par spectrophotomètre.
23. Conserver l'échantillon d'ARN à -80 ° C.
24. (QC Facultatif) Vérifiez la qualité de l'ARN en utilisant une BioAnalyzer Agilent, ou en exécutant l'échantillon sur un gel dénaturant et en vérifiant les lectures de DO. (260 nm et 260/280 ratio)

Discussion

Étapes critiques

Partie 1 & 2

Il ya plusieurs étapes essentielles à la mise en place d'une infection synchrone de la vaccine, le premier en faisant attention de sonication (ou trypzinizing) du virus, afin de désagréger les particules virales. Vaccine est fortement sujette à l'agrégation, et la perturbation des particules de virus est importante pour assurer même l'infection de cellules. Afin d'atteindre une infection synchrone, une MOI éle...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIzol Reagent	Reagent	Invitrogen	15596-026	Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work.
BCP Phase Separation Reagent	Reagent	Molecular Research Center	BP151
RNase-Free DNase Set	Reagent	Qiagen	79254	DNase treatment is an optional step.