Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 1

Resumo

Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 1 de 3.

Resumo

A família

Protocolo

Parte 1: Configurando a infecção

1. Cultivar células HeLa em frascos e espere até que as células são aproximadamente 80% confluentes.
2. Prepare o suficiente meio de crescimento viral para o experimento: DMEM regular com 2% FBS e sem antibióticos acrescentou.
3. A infecção pode ser realizada com o estoque bruto de um vírus vaccinia com um título conhecido, ou sacarose purificada vírus com um título conhecido, se você estiver preocupado com a expressão do gene host.
4. Se você estiver usando vírus sacarose purificada, prossiga diretamente para a parte 2.
5. Se você estiver usando uma ação do vírus vaccinia bruto, pouco antes da infecção, sonicate uma alíquota do vírus em um sonicador copo com um banho de gelo e principalmente um pouco de água.
   • Sonicado em torno de 30W por 20 segundos.
   • Vortex do tubo e repetir a sonicação 3 vezes, acrescentando mais gelo se necessário para manter o copo cheio de gelo e refrigerada.
   • Vortex entre cada passo sonicação.
   • Proceda a parte 2.
6. Alternativamente, se você não possuir um sonicador copo, misture um volume igual de o estoque de vírus bruto e tripsina 0.25mg/mL.
   • Vortex vigorosamente.
   • Incubar o vírus mix de ações / tripsina a 37 ° C banho-maria por 30 minutos.
   • Vortex em intervalos de 5-10 minutos.
   • Proceda a parte 2.

Parte 2: células Infectando

1. Calcular a quantidade de partículas virais necessários para infectar a monocamada na multiplicidade desejado de infecção (MOI). Normalmente, uma alta MOI (entre 5 e 10) é usado para timecourses infecção.
2. Adicione a quantidade desejada de vírus sacarose purificada ou vírus bruto tripsinizados a 37 ° C viral meios de crescimento e misture bem. Você deve usar a mídia apenas o suficiente para cobrir o fundo do balão. Por exemplo, 10 mL dos meios de comunicação para um frasco de T-175.
3. Remova a mídia a partir de células e enxágüe com temperatura ambiente PBS.
4. Adicione o vírus / media o crescimento viral em cada balão.
   • Agite, placas de inclinação e incubar a 37 ° C em uma incubadora de CO2 de 5% por 1 hora.
   • Placas de inclinação e agite a cada 15 minutos para espalhar vírus de maneira uniforme e manter as células úmido.
   • Para um ponto no tempo 0hr/Mock, adicione o meio de crescimento viral só, sem vírus acrescentou.
5. Após a incubação de 1 hora, retire a mídia que contém o vírus, e lavar três vezes com PBS em temperatura ambiente.
6. Adicionar a quantidade máxima de meio de crescimento viral em cada balão. Por exemplo, 30 mL dos meios de comunicação para um frasco de T-175. Começar a contar isso como o ponto de tempo 0 hr.

Parte 3: células colheita

1. Verifique as células sob um microscópio e observe qualquer efeito citopático (CPE).
2. Remova a mídia e lavar as células com 30 mL de PBS à temperatura ambiente.
3. Adicionar 15 mL de tripsina para as células e incubar por 2-5min a 37 ° C.
4. De seleção em microscópio para desprendimento de células e toque em frasco suavemente para deslocar as células.
5. Transferência de células com uma pipeta estéril sorológica em um tubo cônico de 50 mL.
6. Lavar o balão com um volume igual de meio de crescimento celular, e adicione a mídia para as células tripsinizados no tubo cônico.
7. Centrifugar as células a 300 x g por 5 minutos em temperatura ambiente.
8. Remova a tripsina / media a partir do pellet celular.
9. Ressuspender o pellet celular em qualquer reagente Trizol ou o tampão de lise do seu kit desejado isolamento do RNA.
10. Se você estiver usando TRIzol, dividir a amostra em 1 mL em alíquotas de 1,5 ml tubos Eppendorf rotulado e congelar a -80 ° C.
11. Repita o procedimento para todos os momentos, a colheita um frasco por ponto de tempo.

Parte 4: extração de RNA de amostras em TRIzol

1. Neste ponto, as amostras devem ser ressuspendidos em reagente Trizol e pronto para ser processado.
2. Adicionar 200μL do reagente Separação de Fase BCP para cada 1 mL de TRIzol em cada tubo. Você pode precisar de transferir a amostra para um tubo maior se você estiver começando para fora com uma grande quantidade de TRIzol.
3. Vortex ou agitar vigorosamente e incubar à temperatura ambiente por 2-3 minutos.
4. Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 15 minutos.
5. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. A fase aquosa é a camada clara na parte superior. Você deve estar se recuperando aproximadamente 600μL para cada 1mL de TRIzol você começou com.
6. Fazer uma segunda extração fenol / clorofórmio, desta vez utilizando 500μL de clorofórmio por 1 ml TRIzol, em vez de BCP.
7. Vortex ou agitar vigorosamente e incubar à temperatura ambiente por 2-3 minutos.
8. Centrifugar a amostra a 12.000 xg por 15 minutos.
9. Transferir a fase aquosa para um novo tubo. A fase aquosa é a camada clara na parte superior.
10. Adicionar 20μg de acrilamida linear para cada amostra. A acrilamida linear age como uma transportadora e ajuda a precipitar o RNA.
11. Adicionar 500 & micro; L de isopropanol por 1 ml de TRIzol você começou com a cada amostra e misture bem.
12. Incubar as amostras à temperatura ambiente por 10 minutos.
13. Centrifugar em microcentrífuga à velocidade máxima, por 10-15 minutos.
14. O pellet de RNA será visível na parte inferior do tubo. Com muito cuidado, remover o sobrenadante do tubo, ou com um aspirador de pó, ou manualmente por pipetador. Não perturbar o pellet.
15. Lave o pellet com 1 mL de etanol 70%.
    • Adicionar 1 mL de etanol 70% para o sedimento.
    • Centrifugar a velocidade máxima 14.000 g por 5-7 minutos.
    • Com muito cuidado, remover o etanol do tubo, ou com um aspirador de pó, ou manualmente por pipetador. Verifique se o pellet é visível na parte inferior do tubo.
    • Desprezar o sobrenadante.
16. Repita o passo de lavagem. Após o sobrenadante é descartado, marcar onde pellet é no tubo.
17. Ar seco pellet por não mais que 5 minutos. Não overdry, ou o RNA será difícil reconstituir!
18. Se você deseja seguir o tratamento DNase opcional para remover qualquer DNA restante da amostra, ressuspender o sedimento em 17μL de água livre de nuclease. Caso contrário, ressuspender o sedimento em 20μL de água livre de nuclease e continuar para o passo 22.
19. (Tratamento DNase Opcional) Usando o Qiagen RNase set DNase, adicione 2μL buffer RDD e 1μL reconstituído RNase DNase I da RNA ressuspendido. Misture delicadamente.
20. (Tratamento DNase Opcional) Incubar a 37 ° C por 30 minutos.
21. (Tratamento DNase Opcional) Adicione 2μL de 2,5 mM EDTA e incubar a 65 ° C por 5 minutos para inativar a DNase. Não exceda o tempo de inativação ou temperatura as vezes mais longos / temperaturas mais elevadas podem causar a degradação do RNA.
22. Verificar a concentração de RNA por espectrofotometria.
23. Conservar a amostra de RNA a -80 ° C.
24. (QC Opcional) Verifique a qualidade do RNA usando um Bioanalyzer Agilent, ou executando a amostra em um gel desnaturante e verificar as leituras OD. (260nm e 260/280 ratio)

Discussão

Passos crítica

Parte 1 & 2

Existem vários passos críticos para a criação de uma infecção vaccinia síncrona, a sonicação ser o primeiro cuidado (ou trypzinizing) do vírus, a fim de desagregar as partículas do vírus. Vaccinia é altamente propensos a agregar, e ruptura de partículas do vírus é importante para assegurar mesmo a infecção de células. A fim de alcançar uma infecção síncrono, uma alta MOI (superior a 2) deve ser usado para garantir...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIzol Reagent	Reagent	Invitrogen	15596-026	Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work.
BCP Phase Separation Reagent	Reagent	Molecular Research Center	BP151
RNase-Free DNase Set	Reagent	Qiagen	79254	DNase treatment is an optional step.