Vaccinia вирусной инфекции и временной анализ вируса экспрессия генов: часть 1

Резюме

Протокол Vaccinia заражения клеток HeLa и анализ хозяина и вирусных экспрессии генов. Часть 1 из 3.

Аннотация

Семья

протокол

Часть 1: Настройка инфекции

1. Расти HeLa клеток в колбах и ждать, пока клетки приблизительно на 80% вырожденная.
2. Подготовка достаточно вирусных питательную среду для эксперимента: регулярные DMEM с 2% ЭТС и без добавления антибиотиков.
3. Инфекция может быть выполнена либо с сырой запасов вируса коровьей оспы с известным титром, или сахароза очищенный вирус с известным титром, если вы беспокоитесь о хост экспрессии генов.
4. Если вы используете сахарозы очищенный вирус, переходите к части 2.
5. Если вы используете сырой вируса коровьей оспы акций, непосредственно перед инфекцией, разрушать ультразвуком аликвоты вируса в чашку sonicator с ванной в основном из льда и небольшого количества воды.
   • Разрушать ультразвуком около 30 Вт в течение 20 секунд.
   • Вихревые трубки и повторить обработку ультразвуком в 3 раза, добавляя больше льда, если это необходимо держать чашку упакован со льдом и охлажденным.
   • Vortex между каждым шагом обработки ультразвуком.
   • Приступить к части 2.
6. Или же, если вы не обладаете чашку sonicator, смешать равные объемы сырой запас вируса и 0.25mg/mL трипсина.
   • Vortex энергично.
   • Инкубируйте вирус запасов / трипсин смеси в 37 ° С водяной бане в течение 30 минут.
   • Vortex на 5-10 минутным интервалом.
   • Приступить к части 2.

Часть 2: Заражение клетки

1. Рассчитать количество вирусных частиц необходимо, чтобы заразить монослоя на желаемом множественности заражения (МВД). Как правило, высокие МВД (между 5 и 10) используется для инфекции timecourses.
2. Добавить необходимое количество сахарозы очищенный вирус или вирус трипсином сырой до 37 ° C вирусных питательной среды и хорошо перемешать. Вы должны использовать достаточно средств массовой информации, чтобы только покрыть дно колбы. Например, 10 мл среды для Т-175 колбу.
3. Удаление информации из ячеек и промойте комнатной температуре PBS.
4. Добавить вирус / вирусный питательной среды для каждой колбе.
   • Swirl мягко, наклона пластин и инкубировать при температуре 37 ° С в 5% СО2-инкубатора в течение 1 часа.
   • Наклон и вихревые пластин каждые 15 минут распространение вируса равномерно и сохранить клетки влажным.
   • Для момента времени 0hr/Mock, добавить вирусные медиа роста только, без каких-либо вирус, добавленный.
5. После 1 часа инкубации удалить средах, содержащих вирус, и полоскать в три раза при комнатной температуре PBS.
6. Добавить максимальное количество вирусных питательную среду для каждого флакона. Например, 30 мл среды для Т-175 колбу. Начало подсчета этом качестве точки 0 раз в час.

Часть 3: Уборочная клетки

1. Проверьте клетки под микроскопом и отметить любые цитопатический эффект (ЦПЭ).
2. Выньте материал и промойте клетки с 30 мл комнатной температуре PBS.
3. Добавьте 15 мл трипсина в клетки и инкубировать в течение 2-5мин при температуре 37 ° C.
4. Проверьте под микроскоп для мобильного отряда и нажмите колбе осторожно, чтобы выбить клеток.
5. Передача клеток с стерильных серологические пипетки в 50 мл коническую трубку.
6. Промыть колбу с равным объемом средств массовой информации роста клеток, а также добавлять СМИ трипсинизировали клеток в конической трубе.
7. Центрифуга клетки при 300 х г в течение 5 минут при комнатной температуре.
8. Удалить трипсина / СМИ от осадок клеток.
9. Ресуспендируют осадок клеток в любом TRIzol реагента или лизис буфера от желаемого комплект изоляции РНК.
10. Если вы используете TRIzol, разделить образца в 1 мл аликвоты в 1,5 мл меченых труб Эппендорф и заморозить при -80 ° C.
11. Повторите эти действия для всех временных точках, сбор урожая в одном флаконе момент времени.

Часть 4: РНК добыча образцов в TRIzol

1. На данный момент, ваши образцы должны быть ресуспендировали в TRIzol реагента и готовы к обработке.
2. Добавить 200 мкл реагента Разделение фаз BCP на каждый 1 мл TRIzol в каждой трубке. Возможно, вам придется перенести образец больше трубку, если вы начинаете с большим количеством TRIzol.
3. Vortex или энергично встряхивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 2-3 минут.
4. Центрифуга образца при 12 000 мкг в течение 15 минут.
5. Передача водной фазы в новую пробирку. Водную фазу прозрачный слой на самом верху. Вы должны быть в восстановление примерно 600μL на каждый 1 мл TRIzol вы начали с.
6. У второго фенол / хлороформ добычи, на этот раз используя 500 мкл хлороформа на 1 мл TRIzol, вместо того, BCP.
7. Vortex или энергично встряхивают и инкубируют при комнатной температуре в течение 2-3 минут.
8. Центрифуга образца при 12 000 мкг в течение 15 минут.
9. Передача водной фазы в новую пробирку. Водную фазу прозрачный слой на самом верху.
10. Добавить 20 мкг линейных акриламида для каждого образца. Линейные акриламида выступает в качестве носителя и помогает осадок РНК.
11. Добавить 500-миCRO, L изопропанола на 1 мл TRIzol вы начали с для каждого образца и хорошо перемешать.
12. Инкубируйте образцы при комнатной температуре в течение 10 минут.
13. Центрифуга в микроцентрифужных на максимальной скорости в течение 10-15 минут.
14. РНК гранулы будут видны в нижней части трубы. Очень осторожно, удалить супернатант из трубки, либо с вакуумным аспиратором, или вручную с помощью пипетки. Не беспокоить гранул.
15. Вымойте гранул с 1 мл 70% этанола.
    • Добавить 1 мл 70% этанола, пеллет.
    • Центрифуга с максимальной скоростью 14 000 г в течение 5-7 минут.
    • Очень осторожно, удалить этанола из трубки, либо с вакуумным аспиратором, или вручную с помощью пипетки. Убедитесь, что гранулы видна в нижней части трубы.
    • Удалите супернатант.
16. Повторите мыть шаг. После надосадочную отбрасывается, отметить, где осадок на трубке.
17. Воздух сухой шарик на срок не более 5 минут. Не пересушивать или РНК будет трудно восстановить!
18. Если вы хотите следовать необязательный лечения ДНКазы для удаления остатков ДНК из образца, ресуспендируют осадок в 17μL нуклеазы без воды. В противном случае, ресуспендируют осадок в 20 мкл нуклеазы без воды и перейдите к шагу 22.
19. (Дополнительно лечение ДНКазы) Использование Qiagen РНКазы без ДНКазы установлен, добавить 2μL буфера RDD и 1 мкл РНКазы восстановленный без ДНКазы я к ресуспендировали РНК. Осторожно перемешать.
20. (Дополнительно лечение ДНКазы) Инкубировать при 37 ° С в течение 30 минут.
21. (Дополнительно лечение ДНКазы) Добавить 2μL в 2,5 мМ ЭДТА и инкубировать при температуре 65 ° С в течение 5 минут для инактивации ДНКазы. Не превышайте время инактивации или температуры как раз больше / более высоких температурах может привести к деградации РНК.
22. Проверьте концентрацию РНК спектрофотометр.
23. Храните образцы РНК при температуре -80 ° C.
24. (Дополнительно КК) Проверьте качество РНК с использованием Agilent BioAnalyzer, или путем запуска образца на денатурирующих гель и проверки OD чтениях. (260nm и 260/280 отношение)

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Критические Шаги

Часть 1 и 2

Есть несколько важных шагов для создания синхронной инфекции вакцины, первая из которых осторожны ультразвуком (или trypzinizing) вируса, чтобы разбить вирусных частиц. Vaccinia очень склонны к агрегирования, и нарушение вирусных частиц им...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIzol Reagent	Reagent	Invitrogen	15596-026	Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work.
BCP Phase Separation Reagent	Reagent	Molecular Research Center	BP151
RNase-Free DNase Set	Reagent	Qiagen	79254	DNase treatment is an optional step.