Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Parte 1

Riepilogo

Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l'espressione genica virale. Parte 1 di 3.

Abstract

La famiglia

Protocollo

Parte 1: Impostare l'infezione

1. Crescere le cellule HeLa in fiaschi e aspettare che le cellule sono circa l'80% confluenti.
2. Preparare abbastanza virale medio di crescita per l'esperimento: regolare DMEM con il 2% FBS e senza antibiotici aggiunti.
3. L'infezione può essere effettuata sia con uno stock di greggio virus vaccinia con un titolo noto, o saccarosio virus purificato con un titolo noto se sei preoccupato per ospitare espressione genica.
4. Se si utilizza virus saccarosio purificato, procedere direttamente alla parte 2.
5. Se si utilizza un magazzino greggio virus vaccinico, appena prima l'infezione, sonicare un'aliquota del virus in un sonicatore tazza con un bagno di ghiaccio e per lo più un poco d'acqua.
   • Sonicare a circa 30 W per 20 secondi.
   • Vortex il tubo e ripetere la sonicazione 3 volte, aggiungendo più ghiaccio se necessario per mantenere la coppa piena di ghiaccio e freddo.
   • Vortex tra un passo e sonicazione.
   • Procedere alla parte 2.
6. In alternativa, se non si possiede un sonicatore tazza, mescolare un uguale volume dello stock del virus greggio e tripsina 0.25mg/mL.
   • Energicamente.
   • Incubare il brodo / tripsina mix di virus a 37 ° C bagnomaria per 30 minuti.
   • Vortex ad intervalli di 5-10 minuti.
   • Procedere alla parte 2.

Parte 2: le cellule Infezione

1. Calcolare la quantità di particelle virali necessari per infettare il monostrato alla molteplicità desiderato di infezione (MOI). Tipicamente, un alto MOI (tra 5 e 10) è utilizzato per timecourses infezione.
2. Aggiungere la quantità desiderata di virus saccarosio purificato o trypsinized virus greggio a 37 ° C terreni di crescita virale e mescolare bene. Si dovrebbe usare mezzi sufficienti a coprire appena il fondo del pallone. Ad esempio, 10 ml di media per un T-175 pallone.
3. Rimuovere i supporti dalle cellule e lavare con PBS temperatura ambiente.
4. Aggiungere il virus / media della crescita virale ad ogni pallone.
   • Agitare delicatamente, piastre inclinazione e incubare a 37 ° C in un incubatore a CO2 del 5% per 1 ora.
   • Piastre di inclinazione e turbolenza ogni 15 minuti per diffondere virus in modo uniforme e mantenere le cellule umido.
   • Per un punto temporale 0hr/Mock, aggiungere i terreni di coltura virale solo, senza virus aggiunto.
5. Dopo l'incubazione 1 ora, rimuovere il supporto contenente il virus, e lavare tre volte con PBS temperatura ambiente.
6. Aggiungere la quantità massima di terreno di coltura virale ad ogni pallone. Per esempio, 30 ml di media per un T-175 pallone. Comincia a contare questa come punto 0 tempo hr.

Parte 3: Raccolta delle cellule

1. Controllare le cellule al microscopio e nota alcun effetto citopatico (CPE).
2. Togliere la carta e lavare le cellule con 30 ml di PBS temperatura ambiente.
3. Aggiungere 15 mL di tripsina alle cellule e incubare per 2-5min a 37 ° C.
4. Controllare al microscopio per il distacco delle cellule e toccare fiasco delicatamente per staccare le cellule.
5. Trasferire le cellule con una pipetta sterile sierologica in una provetta da 50 ml.
6. Lavare il pallone con un uguale volume di mezzi di crescita delle cellule, e aggiungere la media per le cellule trypsinized nel tubo conico.
7. Centrifugare le cellule a 300 x g per 5 minuti a temperatura ambiente.
8. Rimuovere la tripsina / supporti dal pellet.
9. Risospendere il pellet cellulare in entrambi i reagenti TRIzol o il tampone di lisi dal kit desiderato isolamento del RNA.
10. Se si utilizza TRIzol, dividere il campione in 1 mL aliquote in provette etichettate Eppendorf 1,5 ml e congelare a -80 ° C.
11. Ripetere l'operazione per tutti i tempi, la raccolta un pallone per ogni punto del tempo.

Parte 4: estrazione di RNA di campioni in TRIzol

1. A questo punto, i campioni devono essere risospesi in reagente TRIzol e pronto per essere lavorato.
2. Aggiungere 200μL di reagente separazione di fase BCP per ogni 1 ml di TRIzol in ciascun tubo. Potrebbe essere necessario trasferire il campione ad un tubo più grande se si sta partendo con una grande quantità di TRIzol.
3. Vortex o agitare vigorosamente e incubare a temperatura ambiente per 2-3 minuti.
4. Centrifugare il campione a 12.000 xg per 15 minuti.
5. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. La fase acquosa è lo strato più chiaro sulla parte superiore. Si dovrebbe essere il recupero di circa 600μL per ogni 1 ml di TRIzol hai iniziato con.
6. Fare una seconda estrazione fenolo / cloroformio, questa volta usando 500μL di cloroformio per 1 ml TRIzol, invece di BCP.
7. Vortex o agitare vigorosamente e incubare a temperatura ambiente per 2-3 minuti.
8. Centrifugare il campione a 12.000 xg per 15 minuti.
9. Trasferire la fase acquosa in una nuova provetta. La fase acquosa è lo strato più chiaro sulla parte superiore.
10. Aggiungi 20μg di acrilamide lineare per ogni campione. L'acrilamide lineare agisce come un vettore e aiuta a precipitare l'RNA.
11. Aggiungere 500 e micro; L di isopropanolo per 1 ml di TRIzol hai iniziato con a ciascun campione e mescolare bene.
12. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti.
13. Centrifuga in una microcentrifuga a velocità massima per 10-15 minuti.
14. Il pellet di RNA sarà visibile nella parte inferiore del tubo. Con molta attenzione, rimuovere il surnatante dal tubo, o con un aspiratore a vuoto, o manualmente pipettatore. Non disturbare il pellet.
15. Lavare il pellet con 1 ml di etanolo al 70%.
    • Aggiungere 1 ml di etanolo al 70% al pellet.
    • Centrifugare alla massima velocità 14.000 g per 5-7 minuti.
    • Con molta attenzione, rimuovere l'etanolo dal tubo, o con un aspiratore a vuoto, o manualmente pipettatore. Controllare che il pellet è visibile nella parte inferiore del tubo.
    • Scartare il surnatante.
16. Ripetere la fase di lavaggio. Dopo il supernatante viene scartato, marchio dove pellet è sul tubo.
17. Aria secca a pellet per non più di 5 minuti. Non asciugare eccessivamente, o l'RNA sarà difficile da ricostruire!
18. Se volete seguire il trattamento opzionale DNasi per rimuovere qualsiasi residuo di DNA dal campione, risospendere il pellet in 17μL di acqua priva di nucleasi. Altrimenti, risospendere il pellet in 20μL di acqua priva di nucleasi e continuare al punto 22.
19. (Opzionale trattamento DNasi) Utilizzando la RNasi-free Qiagen set DNasi, aggiungere 2μL Buffer RDD e 1ml ricostituito RNasi-free ho DNasi per l'RNA risospeso. Mescolare delicatamente.
20. (Opzionale trattamento DNasi) Incubare a 37 ° C per 30 minuti.
21. (Opzionale trattamento DNasi) Aggiungere 2μL di 2,5 mM EDTA e incubare a 65 ° C per 5 minuti per inattivare la DNasi. Non superare il tempo di inattivazione o la temperatura, come più volte / alte temperature possono provocare la degradazione dell'RNA.
22. Controllare la concentrazione di RNA da spettrofotometro.
23. Conservare il campione di RNA a -80 ° C.
24. (QC Opzionale) Verificare la qualità dell'RNA utilizzando un Bioanalyzer Agilent, o eseguendo il campione su un gel denaturante e controllando le letture OD. (260 nm e 260/280 ratio)

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Discussione

Passaggi critici

Part 1 & 2

Ci sono diversi passaggi critici della costituzione di una infezione sincrona vaccinia, il primo sonicazione facendo attenzione (o trypzinizing) del virus, in modo da disaggregare le particelle del virus. Vaccino è fortemente incline alla aggregazione e disgregazione di particelle del virus è importante per garantire anche l'infezione delle cellule. Al fine di ottenere una infezione sincrona, un alto MOI (maggiore di 2) deve esser...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIzol Reagent	Reagent	Invitrogen	15596-026	Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work.
BCP Phase Separation Reagent	Reagent	Molecular Research Center	BP151
RNase-Free DNase Set	Reagent	Qiagen	79254	DNase treatment is an optional step.