Vaccinia זיהום בנגיף וניתוח הזמני של ביטוי גנים וירוס: חלק 1

Summary

פרוטוקול Vaccinia זיהום של תאים הלה וניתוח של המארח ביטוי גנים ויראליים. חלק 1 מתוך 3.

Abstract

המשפחה

Protocol

חלק 1: הגדרת זיהום

1. לגדל תאים הלה ב צלוחיות ולהמתין עד התאים הם כ 80% ומחוברות.
2. הכינו מספיק בינוני צמיחה ויראלי לניסוי: DMEM קבוע עם 2% FBS ללא אנטיביוטיקה הוסיף.
3. הזיהום יכול להתבצע גם עם מלאי גולמי של הנגיף vaccinia עם כייל ידוע, או סוכרוז מטוהרים וירוס עם כייל ידוע אם אתה מודאג לגבי ביטוי גנים המארח.
4. אם אתה משתמש וירוס סוכרוז מטוהרים, להמשיך ישירות חלק 2.
5. אם אתה משתמש מלאי וירוס גולמי vaccinia, זמן קצר לפני הזיהום, sonicate aliquot של הנגיף sonicator כוס עם אמבטיה של קרח בעיקר מעט מים.
   • Sonicate בסביבות 30W למשך 20 שניות.
   • וורטקס הצינור וחזור על sonication 3 פעמים, הוספת קרח יותר אם יש צורך לשמור על כוס מלא קרח צונן.
   • וורטקס בין כל שלב sonication.
   • המשך חלק 2.
6. לחלופין, אם אינכם בעלי sonicator כוס, לערבב נפח שווה של המניה וירוס גולמי טריפסין 0.25mg/mL.
   • וורטקס במרץ.
   • דגירה המניות / טריפסין וירוס לערבב 37 ° C waterbath במשך 30 דקות.
   • וורטקס במרווחים 50-10 דקות.
   • המשך חלק 2.

חלק 2: הדבקת תאים

1. לחשב את הסכום של חלקיקים נגיפיים צריך להדביק את monolayer על ריבוי הרצוי של זיהום (משרד הפנים). בדרך כלל, גבוה הפנים (בין 5 ל 10) משמש timecourses זיהום.
2. מוסיפים את כמות הרצויה של וירוס סוכרוז מטוהרים או וירוס גולמי trypsinized על 37 מעלות צלזיוס צמיחה התקשורת ויראלי ומערבבים היטב. אתה צריך להשתמש בתקשורת מספיק כדי לכסות רק את החלק התחתון של הבקבוק. לדוגמה, 10 מ"ל של המדיה עבור בקבוק T-175.
3. הסר מדיה מן התאים ולשטוף עם בטמפרטורת החדר PBS.
4. הוסף את הוירוס / מדיה צמיחה ויראלי בקבוק אחד.
   • מערבולת בעדינות, צלחות הטיה לדגור על 37 מעלות צלזיוס ב 5% CO2 בחממה במשך שעה 1.
   • צלחות הטיה מערבולת כל 15 דקות כדי להפיץ וירוס אחיד לשמור תאים לחים.
   • עבור נקודת זמן 0hr/Mock, מוסיפים את התקשורת צמיחה ויראלי בלבד, עם וירוס לא הוסיף.
5. לאחר דגירה 1 שעה, להסיר את המדיה המכילים את הנגיף, ולשטוף שלוש פעמים עם בטמפרטורת החדר PBS.
6. הוסף את הסכום המקסימלי של מדיום הגידול ויראלי בקבוק אחד. לדוגמה, 30 מ"ל של המדיה עבור בקבוק T-175. מתחילים לספור את זה כנקודת 0 hr שלך זמן.

חלק 3: תאים קציר

1. בדוק את התאים תחת מיקרוסקופ לב כל השפעה cytopathic (CPE).
2. הסר את המדיה ולשטוף תאים עם 30 מ"ל של בטמפרטורת החדר PBS.
3. הוסף 15 מ"ל של טריפסין אל התאים דגירה עבור 2-5min על 37 ° C.
4. בדוק במיקרוסקופ על ניתוק התא ברז הבקבוק בעדינות כדי לסלק תאים.
5. העברת תאים עם טפטפת סרולוגיות סטרילי לתוך צינור חרוטי 50 מ"ל.
6. לשטוף את הבקבוק עם נפח שווה של התקשורת צמיחת תאים, ולהוסיף את התקשורת התאים trypsinized בצינור חרוטי.
7. צנטריפוגה התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
8. הסר את טריפסין / מדיה מן התא גלולה.
9. Resuspend התא גלולה ב מגיב או TRIzol או החיץ תמוגה מתיק הרצוי RNA שלך בבידוד.
10. אם אתה משתמש TRIzol, לחלק את הדגימה לתוך 1 מ"ל aliquots שכותרתו צינורות 1.5mL Eppendorf ולהקפיא ב -80 ° C.
11. חזור על הפעולה עבור כל נקודות הזמן, קצירת one בקבוק לכל נקודת זמן.

חלק 4: מיצוי RNA של דגימות TRIzol

1. בשלב זה, דגימות שלך צריך להיות resuspended ב מגיב TRIzol ומוכן להיות מעובד.
2. הוסף 200μL של מגיב הפרדת פאזות BCP עבור כל 1 מ"ל של TRIzol בצינור אחד. ייתכן שיהיה עליך להעביר את הצינור מדגם גדול יותר אם אתה מתחיל עם כמות גדולה של TRIzol.
3. וורטקס תנער במרץ דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות.
4. צנטריפוגה מדגם XG ב 12,000 במשך 15 דקות.
5. מעבירים את השלב מימית לצינור טריים. השלב מימית היא שכבת ברור למעלה. אתה צריך להיות מחלים 600μL כ 1mL עבור כל TRIzol שהתחלת לצאת עם.
6. האם החילוץ פנול / כלורופורם שנייה, הפעם באמצעות 500μL של כלורופורם לכל 1 מ"ל TRIzol, במקום BCP.
7. וורטקס תנער במרץ דגירה בטמפרטורת החדר למשך 2-3 דקות.
8. צנטריפוגה מדגם XG ב 12,000 במשך 15 דקות.
9. מעבירים את השלב מימית לצינור טריים. השלב מימית היא שכבת ברור למעלה.
10. הוסף 20μg של acrylamide ליניארית מדגם זה. Acrylamide ליניארי מעשים כנשא ועוזר לזרז את הרנ"א.
11. הוספת 500 & miקרו; L של isopropanol לכל 1 מ"ל של TRIzol שהתחלת לצאת עם לדגום כל ומערבבים היטב.
12. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות.
13. צנטריפוגה ב microcentrifuge במהירות המרבית במשך 10-15 דקות.
14. גלולה RNA יוצג בחלק התחתון של הצינור. בזהירות רבה, להסיר את supernatant מהצינור, או עם aspirator ואקום, או באופן ידני על ידי pipettor. נא לא להפריע את הכדור.
15. שטפו את הכדור עם 1 מ"ל של אתנול 70%.
    • הוסף 1 מ"ל של אתנול 70% על גלולה.
    • צנטריפוגה שיא של 14,000 גרם במשך 5-7 דקות.
    • בזהירות רבה, להסיר את אתנול מן הצינור, או עם aspirator ואקום, או באופן ידני על ידי pipettor. בדוק כי גלולה גלוי בתחתית הצינור.
    • בטל supernatant.
16. חזור על השלב לשטוף. לאחר supernatant נמחקת, לסמן היכן גלולה היא ברכבת התחתית.
17. האוויר יבש גלולה לא יותר מ 5 דקות. אל overdry, או RNA יהיה קשה לשחזר!
18. אם ברצונך לעקוב אחר הטיפול אופציונלי DNase להסיר כל שאר ה-DNA מן המדגם, resuspend גלולה ב 17μL מים nuclease חינם. אחרת, resuspend גלולה ב 20μL מים nuclease ללא והמשך לשלב 22.
19. (אופציונאלי טיפול DNase) באמצעות מערכת RNase ללא Qiagen DNase, להוסיף 2μL הצפת RDD ו 1μL מחדש RNase ללא DNase אני על RNA resuspended. מערבבים בעדינות.
20. (אופציונאלי טיפול DNase) לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
21. (אופציונאלי טיפול DNase) הוסף 2μL של 2.5 mM EDTA ו לדגור על 65 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות כדי להשבית DNase. אין לעבור את הזמן איון או טמפרטורה כמו פעמים יותר / טמפרטורות גבוהות יותר עלולות לגרום השפלה של רנ"א.
22. בדוק את ריכוז RNA על ידי ספקטרופוטומטר.
23. חנות מדגם RNA ב -80 ° C.
24. (QC אופציונאלי) בדוק את איכות RNA באמצעות BioAnalyzer Agilent, או על ידי הפעלת המדגם על ג'ל denaturing ובדיקת קריאות OD. (260nm ו - 260/280 יחס)

Discussion

קריטי שלבים

חלק 1 & 2

ישנם שלבים קריטיים כמה הגדרת זיהום סינכרוני vaccinia, sonication first להיות זהיר (או trypzinizing) של הנגיף, על מנת disaggregate חלקיקי הנגיף. Vaccinia נוטה מאוד צבירה, לבין שיבוש של חלקיקי נגיף חשוב ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TRIzol Reagent	Reagent	Invitrogen	15596-026	Similar reagents, such as TriPure from Roche, will also work.
BCP Phase Separation Reagent	Reagent	Molecular Research Center	BP151
RNase-Free DNase Set	Reagent	Qiagen	79254	DNase treatment is an optional step.