胞外多糖的OLIGO质谱分析（OLIMP）

摘要

描述一个快速的方法是争取到在细胞外基质多糖结构的见解。该方法采用glycosylhydrolases特异性，灵敏度和质量允许微量的材料加以分析法的优势。这种技术直接用于组织本身的适应性。

摘要

介导的细胞对环境的直接接触是在许多生物细胞外基质。细胞外基质的一个共同点是，它们包含在复杂形式的糖蛋白糖基，蛋白多糖，和/或多糖。例子包括人类和动物细胞组成的纤维状蛋白和蛋白多糖或多糖的植物和真菌的细胞壁主要的细胞外基质，蛋白多糖/糖脂细菌的细胞壁。所有这些glycostructures都在细胞与细胞和细胞环境的通信和信号中扮演重要的角色。

一个非凡的细胞外基质的复杂的例子是在目前较高的植物细胞墙。他们的墙几乎完全是由糖，干重的75％，这个星球上最丰富的生物聚合物组成。因此，研究如何最好的利用这些材料作为一个碳中性的可再生资源，以取代化石燃料衍生石化进行。燃料转换的主要挑战仍然是酶解或化学降解，由于在目前这种独特的生物复合材料的独特glycostructures墙顽抗。

在这里，我们目前的植物细胞壁glycostructures的快速，灵敏的分析方法。这种方法OLIGO质谱分析（OLIMP）是基于从墙体材料促进特定glycosylhydrolases和后续分析的可溶性寡糖混合物使用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/MS的低聚糖的酶释放^1）（图1）。 OLIMP要求墙壁只有5000细胞为一个完整的分析，可以对组织本身²的执行，并适合高通量^分析 3 。虽然由OLIMP溶解低聚糖的绝对数额不能确定的各种寡糖离子的相对丰度，可以划定从大众给予在墙上的原生多糖的替代模式的见解光谱。

OLIMP可用于分析的墙聚合物的种类繁多，仅^由 4个特定酶的可用性的限制。例如，在植物细胞壁的酶聚合物的分析可用来分析的半纤维素xyloglucan ^{使用xyloglucanase 5，11，12，13，}木聚糖使用远藤-β-（1-4），木^聚糖酶6,7 ，或使用相结合的一个多聚半乳糖醛酸酶和^{methylesterase} 8果胶多糖。此外，使用OLIMP glycosylhydrolase，甚至糖基转移酶活动相同的原则，可以监测和确定^9。

研究方案

OLIMP方法是体现在双子叶植物，xyloglucan的细胞壁中存在的主要半纤维素，使用的是内切葡聚糖酶的glycosylhydrolase。该方法是证明整个拟南芥植物组织源。酶和细胞外基质材料上使用相同的步骤取决于所需的分析，可替代。

1。细胞墙隔离

1. 收获五个为期5天的老整个拟南芥幼苗或您所需材料的同等数额，并转移到1.5ml的反应管。确保该材料置于试管底部。
2. 反应管在液氮中的样品和管理单元冻结顶部添加两个3毫米金属球。
3. 研磨冷冻样品使用一个球磨（下午2时30分至2分钟，25HZ）。
4. 加入1ml 70％的含水乙醇样品。删除使用磁铁的金属球。涡彻底。
5. 离心14000 RPM为10分钟，以颗粒不溶于醇残留物含有细胞壁物质的样品。
6. 小心取出上清液吸。确保不打扰颗粒。
7. 氯仿/甲醇（1:1 V / V）溶液，加入1毫升。涡彻底悬浮颗粒。
8. 在10分钟14000转离心样品，并小心取出上清液吸。确保不打扰颗粒。
9. 使用浓缩干燥样品。

2。溶低聚糖

1. 对于增溶在其低聚糖的形式，尤其是多糖悬浮在一个适当的缓冲液25μl的干燥颗粒。内切葡聚糖酶50MM酸铵，PH4.5，是使用。新增的内切葡聚糖酶0.2U。涡的悬挂和自旋液体下来。
2. 孵育16h后的样品在37 ° C的孵化器，在300RPM晃动。
3. 取出的精华（水）使用一个集中的溶剂。

3。 MALDI - TOF分析发布低聚糖

1. BioRex MSZ 501阳离子交换树脂用于去除盐类和酶消化的样品。条件放置在一个空列等分和大量的水冲洗珠小珠。
2. 5-10 BioRex珠消化和干燥样品。然后添加加入10μl水，可用于数额较小的水材料5μL。溶液中浸泡简要纺纱管珠。在室温下孵育至少10分钟。
3. 现货2μL矩阵（2,5 - 二羟基苯甲酸（DHB），在水中10mg/ml的）到MALDI靶盘。下导致同质矩阵化学晶体的真空溶剂蒸发矩阵。
4. 脱盐，目标板上的矩阵晶体样品溶液点2μL。
   
   如果你想现场的大量样品，只保留了3分钟的最大的斑点。这一时限保证，不会干，还首次发现样品。等待一个额外的2分钟，以确保重新溶解在去年发现样品基质和样品寡糖分子充分混合。再用干的真空状态下的目标板。
   
   样本/矩阵结构应在不到1分钟，使同质结晶结晶。
5. 放入一个的MALDI - TOF质谱仪的目标板。机应积极reflectron模式，加快20000V的电压和延迟为350 nm;选定的质量范围应达500-3000（可能会改变依赖于预期的低聚物）。开始发射激光，并收集每个样品100-200光谱，这是编译生成一个具有代表性的平均光谱（图2A）。代表特定寡糖的离子可以由他们过充质量（M / Z）的比例确定。所有感兴趣的离子的离子强度（峰高）应增加高达100％，在每个样品中的低聚糖的相对丰度（图2B）。

原位 OLIMP分析4。

OLIMP也可用于直接省略任何墙壁准备步骤的组织。作为一个例子黄化拟南芥胚轴用于植物组织源。同样，一个内切葡聚糖酶是用来确定的半纤维素xyloglucan的结构。酶和组织材料可以代替所需的分析，根据使用相同的步骤。

1. 收获一个黄化苗和它放到一个空的MALDI靶盘，让苗干。
2. 添加在所需的位置上干苗木0.5μL内切葡聚糖酶（0.4U/μl，50MM酸铵溶解，PH4.5）。确保酶下降触及部分目标板。
3. 放置在密闭容器中，饱和湿度的MALDI靶盘，以避免酶的下降变干。在会议厅内孵育1板6H在37 ° C。
4. 干MALDI靶盘，在真空条件下的植物组织和酶下降。
5. 加入0.5μL矩阵（道亨银行;为10mg / L）的每个干酶点之上。静置2分钟。
6. 在真空条件下干燥MALDI靶盘。
7. 分析样品的MALDI - TOF。地方组织和酶/矩阵（S）现货成的MALDI - TOF质谱仪的目标板。机应积极reflectron模式，加快20000V的电压和延迟为350 nm;选定的质量范围应达500-3000（可能会改变依赖于预期的低聚物）。
8. 启动激光发射到基质/样品的晶体组织旁边。确保你不打组织本身，在这种情况下，分子的飞行时间将关闭。收集20-50％左右谱斑，这是编译生成一个代表性的平均光谱（图3）。代表特定寡糖的离子可以由他们过充质量（M / Z）的比例确定。离子强度（离子身高），可报告和所有感兴趣的离子应增加高达100％，在每个样品中的低聚糖的相对丰度。

5。代表性的成果

在拟南芥中的半纤维素xyloglucan OLIMP分析的一个例子是如图2所示。由于离子质量差异和特点已知酶（内切葡聚糖酶）的特异性的离子可以被分配到具体的寡糖结构（图2A）。显然无法区分，结构异构体。各种低聚糖的相对丰度测定的基本假设（图2B）是他们的质谱响应因子这些低聚糖是非常类似的。如下所示，OLIMP量化高度重复性。然而，请注意，该方法的鲁棒性是高度依赖的信号信噪比的各种低聚糖离子。例如低聚糖的盐或较低的数额污染可以减少这个比例。

该组织本身（原位分析）的OLIMP分析，可以非常小和定义地区的研究涉及很少的样品制备。这里介绍的例子（图3）没有质的（相同的离子），但数量差异（离子强度的变化）之间的拍摄和拟南芥幼苗根组织的观察。 OLIMP方法的排列，从而导致组织的“成像”。

图1。OLIMP使用作为一种植物源的整个拟南芥幼苗的过程流程图。首先，该组织是浸渍和细胞壁物质准备（图片修改野等^10）。然后释放一个特定的壁多糖寡糖使用特定的水解酶。最后，可溶性低聚糖的相对丰度使用MALDI - TOF质谱测定。

图2。OLIMP确定在拟南芥中的黄化苗xyloglucan低聚糖的相对丰度。一）代表xyloglucan寡糖的质谱，每个离子代表一个特定的寡糖结构，结构异构体无法加以区分。 B）为低聚糖的相对丰度测定相应条形图。

图3。 原位 OLIMP使用为例，分析拟南芥黄化苗。每种酶/消化液滴（彩色圆圈）可以独立进行分析，和一个可以得到相应的质谱和分析。

图4。OLIMP，消化，用木聚糖酶（Megazyme）芒草叶材料获得的半纤维素木聚糖谱。

讨论

OLIMP这里介绍的方法，使一个非常敏感和快速的分析，在细胞外基质聚合物。 OLIMP结合酶的释放与随后的MALDI - TOF分析的低聚物。一个的MALDI - TOF谱的生成需要不到一分钟，因此，OLIMP是适合的应用范围广泛，包括高通量的研究，如突变屏幕。 OLIMP不仅限于植物多糖，但有可能被应用于广泛的聚合物，只有通过具体的水解酶限制。然而，OLIMP限制，不能得到的聚合物的绝对丰度。

正如前面提到OLIMP可用于研究多种，在细胞外基质的物种多样性多糖的结构。作为一个例子，如图4代表主要草种的半纤维素，聚糖OLIMP频谱。在这里，来自温带草芒草的细胞壁物质消化使用木聚糖酶。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,5-dihydroxybenzoic acid	Sigma-Aldrich	37550	10mg/mL in water
BioRex MSZ 501(D) Resin	Bio-Rad	142-7425
Endoglucanase	Megazyme	E-CELTR
Xylanase M6	Megazyme	E-XYRU6
3mm metal balls	Retsch	22.455.0011
Beat mill	Retsch	Mixer Mill MM400
MALDI-TOF	Shimadzu Corporation	Axima Performance
MALDI target plate	Kratos Analytical	DE4555TA
SpeedVac	Eppendorf	Vacufuge 5301
Vacuum manifold	EMD Millipore	MSVMHTS00
Vacuum pump	Welch Allyn	DryFast Ultra 2032