Oligo массовой Профилирование (ОЛИМП) из внеклеточных полисахаридов

Резюме

Быстрый способ описан, чтобы получить полное представление о структуре полисахаридов в внеклеточного матрикса. Метод использует специфику glycosylhydrolases и чувствительности масс-спектрометрия позволяет незначительное количество материалов для анализа. Этот метод можно адаптировать для использования непосредственно на самой ткани.

Аннотация

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.

An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.

Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)¹ (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself², and is amenable to high-throughput analyses³. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.

OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes⁴. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase^{5, 11, 12, 13}, xylan using an endo-β-(1-4)-xylanase ^6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase ⁸. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined ⁹.

протокол

Метод ОЛИМП иллюстрируется на основных гемицеллюлозы присутствующие в клеточных стенках двудольных растений, xyloglucan, используя эндоглюканазы как glycosylhydrolase. Метода продемонстрирована с целыми Arabidopsis рассады в качестве источника ткани растения. Фермент и внеклеточного матрикса материал может быть заменен в зависимости от желаемого анализа с использованием той же процедуры.

1. Изоляции клеточной стенки

1. Урожай пять 5-дневных целом Arabidopsis рассаду или эквивалентное количество желаемый материал и перенести их в 1,5 мл трубки реакции. Убедитесь, что материал находится в нижней части трубы.
2. Добавьте два 3 мм металлическими шариками, чтобы реакция трубки в верхней части образца и оснастки заморозить в жидком азоте.
3. Grind замороженного образца с помощью шаровой мельницы (2:30 мин, 25 Гц).
4. Добавить 1 мл 70% водного раствора этанола в образце. Удалите металлические шарики использованием магнита. Vortex тщательно.
5. Центрифуга образца при 14 000 оборотов в минуту в течение 10 минут для осаждения нерастворимых алкоголя остаток, содержащий материал клеточной стенки.
6. Осторожно удалите супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не потревожить осадок.
7. Добавить 1 мл хлороформ / метанол (1:1 об / об) решение. Vortex тщательно ресуспендируют гранул.
8. Центрифуга образца при 14 000 оборотов в минуту в течение 10 мин и осторожно удалите супернатант аспирацией. Убедитесь в том, чтобы не потревожить осадок.
9. Сухой образец с помощью концентратора.

2. Солюбилизация олигосахаридов

1. Для солюбилизации частности полисахарида в форме его олигосахариды ресуспендирования сухих гранул в 25 мкл соответствующего буфера. Для эндоглюканазы 50 мМ формиат аммония, pH4.5, используется. Добавить 0.2U из эндоглюканазы. Vortex подвески и спиновой жидкости вниз.
2. Инкубируйте пробы для 16h при 37 ° C в инкубаторе, качая на 300rpm.
3. Удаление растворителя из дайджеста (воды) с помощью концентратора.

3. MALDI-TOF анализа выпущен олигосахариды

1. BioRex MSZ 501 катион бисером обмен смолы используются для удаления солей и ферментов из переваривается образца. Условие бисером, помещая аликвоту в пустые колонки и стиральной бисер с большим количеством воды.
2. Добавить 5-10 бусин BioRex к переваривается и высушенного образца. Затем добавить 10 мкл воды, на меньшие суммы материальной 5 мкл воды может быть использован. Погрузите бусины в раствор кратко спиннинг трубы. Инкубируйте по меньшей мере 10 мин при комнатной температуре.
3. Пятно 2μl матрицы (2,5-диоксибензойной кислоты (DHB), 10mg/ml в воде) на тарелку целевой MALDI. Evaporate матрицы растворителя под вакуумом приводит к однородной кристаллы химического матрицы.
4. Пятно 2μl из обессоленной решение образца на вершине матрицы кристаллов на целевой пластины.
   
   Если вы хотите обнаружить большое количество образцов только сохранить на кровянистые выделения в течение не более 3 мин. Это временные рамки гарантирует, что первый образец пятнистый не сухой еще. Дождитесь дополнительных 2min для обеспечения тщательного перемешивания снова растворяли матрицы и образца олигосахарид молекул в последней выборки пятнами. Затем высушите визирной пластины в вакууме.
   
   Выборки / матрицы смесь должна кристаллизоваться менее чем за 1 мин включить однородной кристаллизации.
5. Место визирной в MALDI-TOF масс-спектрометра. Машина должна быть установлена ​​в положительном рефлектрон режиме с ускоряющим напряжением 20000V и задержка 350 нм; выбранном диапазоне масса должна быть 500-3000 Da (может меняться в зависимости от ожидаемого олигомеров). Начало стрельбы лазера и собирать 100-200 спектров в образце, которые составляются для получения представителем спектр средней (рис. 2А). Ионы представляющие конкретные олигосахариды можно определить по их массе по обвинению (м / г) отношение. Ионной интенсивности (высота пика) всех ионов интересов должны быть добавлены до 100% в результате относительного обилия каждого олигосахарид в образце (рис. 2В).

4. Натурные анализ ОЛИМП

ОЛИМП также может быть использована непосредственно на ткани минуя какие-либо шаги стене подготовки. В качестве примера этиолированных гипокотиля арабидопсиса как источник растительных тканей используются. Опять же, эндоглюканазы используется для определения структуры xyloglucan гемицеллюлоз. Фермент и тканевого материала могут быть заменены в зависимости от желаемого анализа, используя ту же процедуру.

1. Урожай этиолированных рассады и поместить его на пустую тарелку целевой MALDI и пусть рассаду сухими.
2. Добавить 0.5μl эндоглюканазы (0.4U/μl, растворенного в 50 мМ формиат аммония, pH4.5) на сушеные рассады в нужное положение. Убедитесь, что фермент падение коснется частично целевой пластины.
3. Место пластины MALDI мишени в закрытом контейнере с насыщающей влажности, чтобы избежать этого фермента капля высыхает. Инкубируйте пластины в камере в течение 16ч при температуре 37 ° C.
4. Сухие пластины MALDI мишени с ткани растений и ферментов падение в вакууме.
5. Добавить 0.5μl матрицы (DHB; 10 мг / л) друг на сушеные месте фермента. Оставьте на 2 минуты.
6. Сухие пластины MALDI мишени под вакуумом.
7. Анализ образцов с MALDI-TOF. Место целевой пластина с тканью и фермента / матрицы месте (ы) в MALDI-TOF масс-спектрометра. Машина должна быть установлена ​​в положительном рефлектрон режиме с ускоряющим напряжением 20000V и задержка 350 нм; выбранном диапазоне масса должна быть 500-3000 Da (может меняться в зависимости от ожидаемого олигомеров).
8. Начало стрельбы лазер на матрицу / образец кристаллов Рядом с ткани. Убедитесь, что вы не попали в самой ткани, так как в таком случае времени полета молекул будет отключен. Сбор около 20-50 спектров в месте, которые составляются для получения представителем спектр средней (рис. 3). Ионы представляющие конкретные олигосахариды можно определить по их массе по обвинению (м / г) отношение. Ионной интенсивности (ионных высота) могут быть представлены и все ионы интереса должно быть добавлено до 100% в результате относительного обилия каждого олигосахариды в образце.

5. Представитель Результаты

Примером ОЛИМП анализ xyloglucan гемицеллюлозы присутствует в Arabidopsis саженцев показано на рисунке 2. Из-за разности масс ионов и хорошо известны характеризуется фермента (эндоглюканазы) специфичность ионы могут быть закреплены за конкретными олигосахарид структур (рис. 2А). Очевидно, структурных изомеров не отличаются. Основное предположение, для определения относительного содержания различных олигосахаридов (Рис. 2Б) является то, что их масса спецификации ответ фактор очень похож на тех, олигосахаридов. Как показано здесь, ОЛИМП количественная высокой воспроизводимостью. Тем не менее, следует учитывать, что надежность метода очень сильно зависит от сигнала к шуму различных олигосахаридов ионов. Например загрязнения солями или меньшие количества олигосахаридов может уменьшить этот коэффициент.

ОЛИМП анализ на самой ткани (на месте анализ) позволяет изучать очень маленькие и определенных областях и включает в себя очень мало пробоподготовки. В примере, приведенном здесь (рис. 3) никаких качественных (то же, ионов), но количественные различия (изменение интенсивности ионного) наблюдались между побега и корня-ткани Arabidopsis рассады. Перестановки ОЛИМП-метод может таким образом привести к ткани "изображения".

Рисунок 1. Блок-схема процедуры с использованием ОЛИМП целом саженцев Arabidopsis как растение источника. Во-первых, ткань вымоченных и материальных клеточная стенка готова (картинка редактировался Фуджино и соавт. ^10). Затем олигосахариды частности полисахарид стены выпускаются с использованием специального гидролазы. Наконец, относительного содержания растворимых олигосахаридов, определяются с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии.

Рисунок 2. Относительное обилие xyloglucan олигосахариды в этиолированных сеянцы из Arabidopsis, как это определено ОЛИМП. ) Представитель xyloglucan олигосахарид масс-спектр, каждый ион представляет определенный олигосахарид структуры, структурных изомеров не могут быть выделены. Б) соответствующая диаграмма бар для определения относительной олигосахарид изобилии.

Рисунок 3. Натурные анализ ОЛИМП использованием этиолированных проростков арабидопсиса в качестве примера. Каждый фермент / пищеварение капли (цветные круги) могут быть проанализированы самостоятельно и соответствующие спектры масс могут быть получены и проанализированы.

Рисунок 4. ОЛИМП спектр гемицеллюлозы ксилан получены путем переваривания Miscanthus листа материала с ксиланазы (Megazyme).

Обсуждение

ОЛИМП метод, представленный здесь дает очень чувствительный и быстрый анализ полимеров, присутствующих в внеклеточных матриц. ОЛИМП сочетает ферментативного освобождения олигомеров с последующим MALDI-TOF анализа. Поколение MALDI-TOF спектр занимает менее одной минуты, поэтому ОЛИМП подходит для широкого спектра приложений, включая высокую пропускную способность исследования, такие как мутант экранов. ОЛИМП не ограничивается растительных полисахаридов, но потенциально могут быть применены к широкому кругу полимеров, ограничивается только наличием конкретных гидролитических ферментов. Тем не менее, ограничение ОЛИМП является то, что абсолютное изобилие полимера не могут быть получены.

Как упоминалось ранее ОЛИМП могут быть использованы для изучения структуры различных полисахаридов присутствует в внеклеточного матрикса разнообразия видов. В качестве примера, на рисунке 4 представлена ​​ОЛИМП спектр основных гемицеллюлозы в траве видов, ксилан. Здесь, клеточная стенка материал, полученный из травы умеренных Miscanthus расщепляли использованием ксиланазы.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,5-dihydroxybenzoic acid	Sigma-Aldrich	37550	10mg/mL in water
BioRex MSZ 501(D) Resin	Bio-Rad	142-7425
Endoglucanase	Megazyme	E-CELTR
Xylanase M6	Megazyme	E-XYRU6
3mm metal balls	Retsch	22.455.0011
Beat mill	Retsch	Mixer Mill MM400
MALDI-TOF	Shimadzu Corporation	Axima Performance
MALDI target plate	Kratos Analytical	DE4555TA
SpeedVac	Eppendorf	Vacufuge 5301
Vacuum manifold	EMD Millipore	MSVMHTS00
Vacuum pump	Welch Allyn	DryFast Ultra 2032