細胞外多糖のオリゴマスプロファイリング（オリンプ）

要約

迅速な方法は、細胞外マトリックス中の多糖類の構造についての洞察を得るために説明されています。方法はglycosylhydrolasesの特異性と材料の微量を分析できるように質量分析の感度を利用しています。この手法は、組織自体に直接使用するための適応です。

要約

環境への細胞の直接接触は、細胞外マトリックスによって多くの生物に仲介されている。細胞外マトリックスの一つの一般的な側面は、彼らは複雑な糖の糖タンパク質の形で部分、プロテオグリカン、および/または多糖類を含んでいるということです。例としては、繊維状のタンパク質およびプロテオグリカンや植物と菌類の多糖類ベースの細胞壁を主とする人間と動物細胞の細胞外マトリックス、プロテオグリカン/細菌の糖脂質ベースの細胞壁が含まれています。すべてのこれらのglycostructuresは、細胞間および細胞 - 環境コミュニケーションとシグナル伝達において重要な役割を果たしている。

細胞外マトリックスの異常な複雑な例では、高等植物の細胞壁に存在しています。その壁は、最大75％乾燥重量に、糖からほとんど完全に成って、そしてこの地球上に存在する最も豊富に存在する生体高分子から構成されています。したがって、研究は化石燃料から得られる石油化学製品を置き換えるために、カーボンニュートラルな再生可能資源として最適なこれらの材料を活用する方法を実施しています。燃料転換のための主な課題は、このユニークなbiocompositeに存在するユニークなglycostructuresによる酵素的または化学的劣化に壁の反抗のまま。

ここで、我々は、植物細胞壁のglycostructuresの迅速かつ高感度分析法を提示する。このメソッドオリゴマスプロファイリング（オリンプは）特定のglycosylhydrolasesとマトリックス支援レーザー脱離/イオン化飛行時間型質量分析（MALDI-TOF/MSを用いて可溶化したオリゴ糖混合物のその後の分析を容易にする壁材料からのオリゴ糖の酵素のリリースをベースにしています^1）（図1）。オリンプは、完全な分析のためにのみ5000細胞の壁は、組織自体が²で実行できる必要があり、ハイスループット分析³に従順です。可溶化されたオリゴ糖の絶対量がオリンプによって決定することはできませんが、様々なオリゴ糖のイオンの相対量は、壁に存在する天然多糖の置換パターンについての洞察を与えるマススペクトルから線引きすることができます。

オリンプは、特定の酵素⁴の可用性によって制限壁ポリマー、多種多様な分析をするために使用することができます。例えば、植物細胞壁の酵素に存在するポリマーの分析のためにエンド -β-（1-4）-キシラナーゼ^6,7を使用してキシログルカナーゼ^{5、11、12、13、}キシランを用いたヘミセルロースのキシログルカンを分析するために用意されています、またはポリガラクツロナーゼおよびメチルエステラーゼ⁸の組み合わせを使用して、ペクチン多糖類のため。さらに、オリンプglycosylhydrolaseとさえ糖転移酵素活性のと同じ原理を使用しては監視し^、9を決定することができます。

プロトコル

オリンプメソッドはglycosylhydrolaseとしてエンドグルカナーゼを用いて、双子葉植物、キシログルカンの細胞壁に存在する主要なヘミセルロースに例示される。方法は、植物組織の源としての全体シロイヌナズナ実生を用いて実証されています。酵素と細胞外マトリックス材料は、同じ手順を用いて所望の分析に応じて置換することができます。

1。細胞壁の分離

1. 収穫5人が、5日齢全体シロイヌナズナの苗や、ご希望の材料の相当額と1.5mlの反応管に移す。材料は、チューブの底部に配置されていることを確認します。
2. 液体窒素でのサンプルとスナップ凍結の上に反応管に2つ3ミリメートルの金属のボールを追加。
3. ボールミル（2:30分、25Hzの）を使用して凍結サンプルを挽く。
4. サンプルに1mLの70％水性エタノールを加えます。磁石を用いて金属球を取り外します。徹底的にボルテックス。
5. ペレットに10分細胞壁物質を含有するアルコール不溶性残渣を14,000 rpmでサンプルを遠心分離します。
6. 慎重に吸引して上清を取り除く。ペレットを妨害しないことを確認してください。
7. クロロホルム/メタノール（1:1 v / v）溶液1mLの追加。ペレットを再懸濁させる徹底的にボルテックス。
8. 10分間14,000 rpmでサンプルを遠心し、慎重に吸引して上清を取り除く。ペレットを妨害しないことを確認してください。
9. コンセントレータを使用してサンプルを乾燥させる。

2。オリゴ糖の可溶化

1. 可溶化のために、そのオリゴ糖の形で特定の多糖類は、適切なバッファーの25μlのに乾燥したペレットを再懸濁します。エンドグルカナーゼ50mmのギ酸アンモニウム、pH4.5の場合は、使用されています。エンドグルカナーゼの0.2Uを追加。ダウン渦サスペンションとスピン液体。
2. 37℃で16時間サンプルをインキュベート° Cのインキュベーターで、300rpmで振盪。
3. コンセントレータを使用してダイジェスト（水）の溶剤を削除します。

3。放出オリゴ糖のMALDI - TOF分析

1. BioRex MSZ 501陽イオン交換樹脂ビーズは、消化サンプルから塩と酵素を除去するために使用されています。空のカラムに一定量を配置し、多量の水でビーズを洗浄することにより条件ビーズを。
2. 消化し、乾燥サンプルに5〜10 BioRexビーズを追加。その後、水の材料の5μlの少量を使用することができるために、10μlの水を加えます。簡単にチューブを回転させて、溶液中のビーズを浸す。室温で少なくとも10分間インキュベートする。
3. MALDIターゲットプレートにスポット2μlのマトリックス（2,5 - ジヒドロキシ安息香酸（DHB）、水で10mg/ml）。均一なマトリックスの化学物質の結晶につながる真空下で溶媒マトリックスを蒸発させる。
4. ターゲットプレート上にマトリックスの結晶の上に脱塩試料溶液のスポット2μlの。
   
   あなたが多数のサンプルを発見する場合のみ3分の最高のためにスポッティング続ける。この時間枠は、最初に斑点を付けられたサンプルがまだ乾燥していないことを保証します。最後の斑点のあるサンプルに再溶解し、マトリックスとサンプル糖鎖分子の完全な混合を確実にするために追加の2分間待ちます。その後、真空下でターゲットプレートを乾燥させる。
   
   サンプル/マトリックス混合は、均質な結晶化を有効にするために1分も経たないうちに結晶化する必要があります。
5. MALDI - TOF質量分析計への場所のターゲットプレート。マシンは、20000Vと350nmの遅延の加速電圧と正のリフレクトロンモードに設定する必要があり、選択されている質量範囲500から3000ダ（予想されるオリゴマーに依存して変更される可能性がある）はずです。レーザーを発射起動し、代表的な平均のスペクトル（図2A）を生成するためにコンパイルされているサンプル当たり100から200のスペクトルを、収集する。特定のオリゴ糖を表すイオンが電荷（m / z）比を、その質量によって識別することができます。関心のあるすべてのイオンのイオン強度（ピーク高さ）サンプル中の各オリゴ糖の相対量（図2B）、結果として100％まで追加する必要があります。

（4） その場オリンプの分析では

オリンプは、任意の壁の準備手順を省略する組織に直接使用することができます。例として、植物組織の源としてシロイヌナズナの黄化胚軸が使用されます。再び、エンドグルカナーゼは、ヘミセルロースのキシログルカンの構造を決定するために使用されます。酵素と組織の材料は、同じ手順を用いて所望の分析に応じて置換することができます。

1. 黄化苗を収穫し、空のMALDIターゲットプレート上に置き、苗を乾燥させて。
2. 所望の位置に乾燥させた苗を0.5μlエンドグルカナーゼを（50mmのギ酸アンモニウムに溶解0.4U/μl、、pH4.5）を追加します。酵素の低下が部分的にターゲットプレートに触れていることを確認してください。
3. その酵素ドロップが乾燥を避けるために、飽和湿度で密閉容器にMALDIターゲットプレートを置きます。 1のチャンバー内にプレートをインキュベート37 6H℃、
4. 植物組織および真空下で酵素のドロップとMALDIターゲットプレートを乾燥させます。
5. 各乾燥酵素のスポットの上に、0.5μlの行列を（10mgの/ L DHB）を追加します。それが2分間放置する。
6. 真空下MALDIターゲットプレートを乾燥させます。
7. MALDI - TOFのサンプルを分析する。 MALDI - TOF質量分析計への組織および酵素/マトリックススポット（複数可）でターゲット板を配置。マシンは、20000Vと350nmの遅延の加速電圧と正のリフレクトロンモードに設定する必要があり、選択されている質量範囲500から3000ダ（予想されるオリゴマーに依存して変更される可能性がある）はずです。
8. 組織へNEXTマトリックス/試料結​​晶にレーザーを発射開始。あなたのような分子のフライトの時はoffとなるような場合には、組織自体に該当していないことを確認してください。代表的な平均のスペクトル（図3）を生成するためにコンパイルされているスポット、当たり20から50前後のスペクトルを収集する。特定のオリゴ糖を表すイオンが電荷（m / z）比を、その質量によって識別することができます。イオン強度（イオンの高さ）が報告することができ、関心のすべてのイオンは試料中の各オリゴ糖の相対量で、その結果100％まで追加する必要があります。

5。代表的な結果

シロイヌナズナ実生におけるヘミセルロースのキシログルカンの存在のオリンプ分析の例を図2に示されています。イオンの質量差と知られて十分に特徴付けられた酵素（エンドグルカナーゼ）特異性に起因するイオンは、特定のオリゴ糖の構造（図2A）に割り当てることができます。明らかに、構造異性体を区​​別することができます。様々なオリゴ糖の相対量の決定のための基本的な前提は、（図2B）、その質量分析の応答係数は、それらのオリゴ糖のために非常に似ていることです。ここに示すように、オリンプ定量化は非常に再現性です。しかし、メソッドの堅牢性は、様々なオリゴ糖のイオン対雑音比信号に大きく依存していることに注意してください。例えば塩またはオリゴ糖のより少量の混入は、その比率を減らすことができます。

組織自体のオリンプ分析は、（その場分析で）非常に小さいと定義されている領域の研究を可能にし、非常に少ないサンプル調製を含む。例では、定性的（同じイオン）（図3）ここで紹介しませんが、定量的な違いは、（イオン強度のばらつき） シロイヌナズナ実生の茎と根組織の間で観察された。オリンプ法の順列は、このように組織、"イメージング"につながる可能性があります。

図1植物源として全体シロイヌナズナの苗を使用してオリンプ手順のフローチャート。最初に、組織が ​​漬けられ、細胞壁の材料は（写真は藤野らから変更^。10）用意されています。その後、特定の壁の多糖類のオリゴ糖は、特定の加水分解酵素を使用して解放されています。最後に、水溶性オリゴ糖の相対的存在量をMALDI - TOF質量分析法を用いて決定されます。

図2。オリンプにより決定されたシロイヌナズナから黄化実生におけるキシログルカンのオリゴ糖の相対的な量。 A）代表キシログルカンオリゴ糖質量スペクトルを、それぞれのイオンは、特定の糖鎖構造を表し、構造異性体を区​​別することができます。相対的なオリゴ糖豊富な測定のためのB）対応するバーの図。

図3。例として、 シロイヌナズナの黄化実生を用いてその場オリンプの分析では 。それぞれの酵素/消化液滴（色付きの丸）が独立して分析することができ、対応するマススペクトルが得られ、分析することができます。

キシラナーゼ（Megazyme）とススキの葉の材料を消化し ​​て得られたヘミセルロースのキシランの図4。オリンプスペクトル。

ディスカッション

ここで紹介するオリンプ方法は、細胞外マトリックスに存在するポリマーの非常に敏感かつ迅速な分析が可能になります。オリンプは、後続のMALDI - TOF分析とオリゴマーの酵素的放出を兼ね備えています。 MALDI - TOFスペクトルの生成は、1分未満を受け取り、それ故にオリンプは、このような変異体の画面のようなハイスループット試験を含む広範囲のアプリケーションに適しています。オリンプは、植物の多糖類に限定されるものではなく、潜在的にのみ特異的加水分解酵素の利用可能性によって制限ポリマー、の広い範囲に適用することができます。しかし、オリンプの制限は、ポリマーの絶対的な豊かさが得られないということです。

オリンプが種の多様性の細胞外マトリックスに存在する多糖類の様々の構造を研究するために使用する前に、前述のとおり。例として、図4は、草種の主要なヘミセルロース、キシランのオリンプスペクトルを表しています。ここでは、温帯草ススキ由来の細胞壁の材料は、キシラナーゼを用いて消化した。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2,5-dihydroxybenzoic acid	Sigma-Aldrich	37550	10mg/mL in water
BioRex MSZ 501(D) Resin	Bio-Rad	142-7425
Endoglucanase	Megazyme	E-CELTR
Xylanase M6	Megazyme	E-XYRU6
3mm metal balls	Retsch	22.455.0011
Beat mill	Retsch	Mixer Mill MM400
MALDI-TOF	Shimadzu Corporation	Axima Performance
MALDI target plate	Kratos Analytical	DE4555TA
SpeedVac	Eppendorf	Vacufuge 5301
Vacuum manifold	EMD Millipore	MSVMHTS00
Vacuum pump	Welch Allyn	DryFast Ultra 2032