双荧光原位杂交食脑切片

摘要

该协议涉及非放射性原位杂交程序，使在脊椎动物的大脑薄片，同时识别两个种成绩单，在一个单细胞的决议。

摘要

在这里，我们描述了一个双荧光修改后的版本

研究方案

该协议是基于标准的放射性和非放射性原位杂交方法，以前我们和其他人开发的检测在^脑组织1-7中的一个或两个成绩单物种的发展和完善。下面所描述的协议有2或3天的总长度，这取决于由最终用户选择的程序中断的数量。下面详细的所有步骤都riboprobe杂交步骤和杂交后洗外，在室温下进行。在此方法中涉及的所有步骤所需的解决方案和缓冲区，可以发现在此协议结束。

1。组织准备和切片

1. 斩首，并迅速提取受试者的大脑，并将其放置到一个适当大小的塑料模具。
2. 盖脑组织TEK包埋剂，并迅速在dry-ice/alcohol浴快速冷冻的塑料模具。冰冻组织可存放于-80 ° C，直到使用。
3. 使用低温恒温器，收集到的收费Superfrost加幻灯片幻灯片2或3％的大脑部分。部分的厚度为10-12微米。幻灯片可存放于-80 ° C，直到使用。

2。探针纯化制备葡聚糖G50列

“可以从商业来源购买葡聚糖列，但是，我们在下面提供一个低成本的替代列的一代，将探头净化。

1. 水合物无RNase，DEPC处理过的水（例如，2克的粉末，在DEPC处理过的水100毫升），混合的解决方案简要和在室温下存储足够量的葡聚糖G50粉沉淀多余的葡聚糖G50。
2. 去除上清液（水上层）以下葡聚糖G50降水。
3. 重复过程中，上述3 - 5倍。
4. 最后一次洗涤后，再暂停使用葡聚糖G50在TE缓冲液（1:1比例）的解决方案，并存储在4 ° C。
5. 蒸压成无菌的1 ml注射器玻璃棉和压缩柱塞在底部的致密层，然后放入15毫升猎鹰管的注射器。
6. 充分混匀，在TE溶液葡聚糖G50。该解决方案的填充注射器/列。
7. 在1000 rpm离心30秒列。
8. 重复此过程，直到列的几乎是完全充满葡聚糖G50珠。
9. 将200μL洗涤液的列列，并在1000 rpm 2分钟离心。流丢弃。
10. 将200μL封闭液列列，并在1000 rpm 2分钟旋转。重复此步骤的4-5倍，达到平衡列。列可以存放在4℃直至使用，如果用封口膜密封。

3。标记和纯化的Riboprobes

下面我们详细介绍单一riboprobe的产生和净化。 dFISH，每个探头的准备，将涉及同样的方法，除了一个探头将被标记，而其他与生物素标记的双绞线与地高辛（DIG）标记的UTP。

1. 准备集中（> 150毫微克/微升）和纯化线性利益cDNA的解决方案，以生成感（对照组）或反义riboprobes。
2. 在1.5 ml离心管中，加入0.5-1微克纯化的cDNA为模板，2 5X探针标记缓冲液，1μL10X辛（或生物素）标签混合，0.5μLRNasin 1μL相应的RNA聚合酶，并带来终体积10μL无RNase的水（DEPC处理）的解决方案。
3. 在37℃水浴中孵育的解决方案° C为2小时。
4. 加入1μL的tRNA（股票; 20微克/微升），列封闭液和39μL解决方案。
5. 准备探针纯化的葡聚糖G50列。为此，添加50μL封闭液列，并在1000 rpm旋转10秒。
   重复此步骤2-3次，以平衡列（即，50μL应用于列离心周期后收回）。
6. 应用葡聚糖G50列，位置在列的底部的一个新的离心管的探头解决方案，和自旋为3分钟1000转，获得纯化的50μLriboprobe解决方案。
7. 评估标记riboprobe的质量和产量，使用一个标准的甲醛琼脂糖RNA凝胶，或分光光度计。

4。固定后，乙酰化和杂交

1. 从-80 ° C冰箱中取出的部分，并允许为室温平衡。随后，冷，新鲜的3％为5分多聚甲醛溶液中孵育部分。
2. 简单冲洗在P部分hosphate缓冲液（PBS）的两倍。
3. 脱水部分通过一个标准的酒精系列（70，95，和100％; 2分钟），并让它们风干。
4. 孵育10分钟的乙酰化解决方案的部分。
5. 冲洗2X SSPE的第3次。
6. 再次通过上面所述的标准酒精系列脱水部分，并允许他们风干。
7. 准备足量的杂交液，并添加两个riboprobes的解决方案（探针浓度为1 ng /μL，每个探头）。总成交量为杂交液杂交的节（每节杂交液16μL）的基础上确定。
8. 应用足量的杂交液，以确保没有空气泡沫覆盖组织的组织和盖玻片幻灯片。
9. 放置在一个金属滑动支架幻灯片。在矿物油浴中浸泡持有人，在65 ° C过夜。确保盖玻片是朝上（即幻灯片持有人的侧面应与矿物油的容器底部接触）。

5。后杂交洗

1. 翌日，小心地取出幻灯片的持有人，并从矿物油浴简单冲洗氯仿它从幻灯片中删除多余的油。
2. 放置幻灯片在2X SSPE的解决方案，为5-10分钟。盖玻片应分离，而在溶液中的幻灯片。
3. 转移到一个新的2X SSPE的解决方案的幻灯片，并保持在室温下1小时。
4. 转移到含2X SSPE的加50％甲酰胺溶液中的部分。这种解决方案的温度应该在一夜之间杂交过程中使用的温度相匹配。在此解决方案保持1.5小时的幻灯片。
5. 转让部分杂交步骤相同的温度预热到0.1X SSPE的解决方案。在这部分孵育30分钟的解决方案。重复这一步额外的30分钟。

6。检测和可视化的Riboprobes

1. TNT的缓冲区传输幻灯片，其中0.3％的过氧化氢已经增加了10分钟，。
2. TNT缓冲液，3次（每次10分钟）部分洗净。
3. 使用DAKO笔，良好的周围绘制包含大脑部分区域。重要的是，应谨慎行事，以确保该路段不燥。
4. 每张幻灯片中应用150 TNB的缓冲液，孵育在此解决方案中的部分为30分钟，在潮湿的腔。
5. 通过倾斜的幻灯片中删除多余的TNB的解决方案。
6. 国能在2小时湿热试验箱含有过氧化物酶标记的抗地高辛抗体，并存储幻灯片的解决方案的应用150μL。抗体浓度应分别确定为各的利益来开展dFISH前谈话。
7. 在TNT的缓冲区部分洗净; 3次，每次10分钟。
8. 申请150μLAlexa的594 -共轭酪胺工作的解决方案，以每张幻灯片，并储存在1小时的湿热试验箱。该解决方案应根据制造商的指示准备。
9. 在TNT的缓冲区部分洗净; 3次，每次10分钟。
10. 在TNT的缓冲孵育部分，已添加0.3％的过氧化氢为10 - 30分钟。
11. 在TNT的缓冲区部分洗净; 3次，每次10分钟。
12. 适用于150μL的每张幻灯片的TNB的缓冲区，并保持在一个30分钟的湿热试验箱。
13. 通过倾斜的幻灯片中删除多余的TNB的解决方案。
14. 加入150μL国能在2小时湿热试验箱含有过氧化物酶标记的抗生物素的抗体，并存储幻灯片的解决方案。
15. 在TNT的缓冲区部分洗净; 3次，每次10分钟。
16. 套用一个Alexa 488 - 150μL共轭酪胺的工作方案的幻灯片和1小时的孵化部分。该解决方案应根据制造商的建议准备。
17. 在TNT的缓冲区部分洗净; 3次，每次10分钟。
18. 加入150μL赫斯特溶液（1:1000在TNT的缓冲区）的部分，并保持在2分钟湿热试验箱。
19. 在TNT的缓冲液清洗的部分; 3次，每次5 min。
20. 盖玻片用荧光兼容的安装介质（例如，Vectashield或延长抗淬灭）的部分。

7。代表性的成果

图1，我们在这里展示有代表性的dFISH，在斑马雀脑取得的成果。从caudomedial nidopallium（NCM），哺乳动物的听觉皮层的鸣禽模拟获得的显微照片。脑切片进行杂交与生物素标记的riboprobe针对白蛋白（A）的抑制性神经元亚群的标志物，掏标记核糖探头针对活动依赖的基因zenk（二），为歌曲驱动的神经元的可靠标记。 C）（A）和（B）显示的听觉体验激活的抑制性神经元的人口覆盖。箭头和箭头指示两个riboprobes专门标记的细胞，星号显示代表神经元，表达共同的利益都成绩单。比例尺= 25微米。

讨论

我们使用这个协议来研究脊椎动物的大脑是如何neurochemically和功能组织，并确定如何行为相关的感官刺激的影响在成人^大脑 8-10元基因组机械。我们已经成功地使用这种方法在小鼠，大鼠和鸣禽脑组织，但预计此协议将很容易适应从脊椎动物物种的阵列，或许非神经组织得到的脑切片。需要获得可靠的结果和最佳的信号的关键控制已经详细广泛，本集团其他^{地方11，12} 。

材料