Çift Floresans In situ Taze Beyin Bölüm Hibridizasyon

Özet

Bu protokol bir radyoaktif olmayan içerir In-situ Hibridizasyon işlemi, tek bir hücrenin çözünürlükte, omurgalı beynin ince bölümlerde aynı anda iki transkript türlerin belirlenmesini sağlar.

Özet

Burada bir çift floresan değiştirilmiş bir versiyonu tarif

Protokol

Bu protokol, önce bir ya da iki beyin ^dokusu 1-7 transkript türlerini tespit etmek için, biz ve diğerleri tarafından geliştirilen standart radyoaktif ve radyoaktif olmayan in-situ hibridizasyon yöntemleri, dayalı geliştirilen ve rafine oldu. Aşağıda açıklanan protokol, son kullanıcı tarafından seçilen usul kesintilerinin sayısına bağlı olarak 2 veya 3 gün toplam uzunluğu vardır. Aşağıda ayrıntılı olarak tüm adımları Spastine Özgü Riboprop hibridizasyon adım ve sonrası hibridizasyon yıkar dışında, oda sıcaklığında yapılacak. Bu yöntemde ilgili tüm adımları için gerekli çözümleri ve tamponlar bu protokol sonunda bulunabilir.

1. Doku hazırlanması ve Kesit

1. Başını kesmek ve deneğin beyin hızla ayıklamak ve yeterli büyüklükte plastik bir kalıp içine yerleştirin.
2. Kapak Doku Tek gömme orta beyin ve hızlı bir şekilde hızlı dondurma dry-ice/alcohol banyo plastik kalıp. Dondurulmuş doku -80 ° C kullanana kadar saklanabilir.
3. Bir Kriyostat kullanarak, tahsil SuperFrost Plus Slaytlarınıza slayt başına 2 veya 3 beyin bölümlerde toplamak. Bölümlerde kalınlığı 10-12 mikron olmalıdır. Slaytlar -80 ° C kullanana kadar saklanabilir.

2. Probe Arıtma Sephadex G50 Sütunlar hazırlanması

"Sephadex sütunları ticari kaynaklardan satın alınabilir, ancak, sütunlar, prob arıtma için gerekli olacak nesil için aşağıdaki düşük maliyetli bir alternatif sağlar.

1. RNaz-free, oda sıcaklığında DEPC ile tedavi edilen su (örneğin, 2 gram toz, DEPC arıtılmış su 100 ml), mix çözüm kısaca ve mağaza Sephadex G50 toz Hidrat yeterli miktarda aşırı Sephadex G50 hızlandırabilir.
2. Sephadex G50 yağış (suyun üst tabakası) süpernatantı.
3. 3 - 5 kat yukarıdaki işlemi tekrarlayın.
4. Son yıkamadan sonra, kullanana kadar 4 Sephadex G50 TE tamponu (1:1 oranı) çözüm ve mağaza ° C yeniden askıya.
5. 1 ml steril bir şırınga içine yerleştirin cam yünü otoklavlanabilir ve kompakt bir alt katmanı yapmak için piston ile sıkıştırmak ve sonra 15 ml Falcon tüp içine şırınga.
6. TE Sephadex G50 çözümü karıştırın. Bu çözüm ile şırınga / sütun doldurun.
7. 1000 rpm'de 30 saniye süreyle sütun santrifüjleyin.
8. Sütun neredeyse tamamen Sephadex G50 boncuklar ile dolana kadar bu işlemi tekrarlayın.
9. Sütun sütun yıkama tamponu 200 ul uygulayın ve 1000 rpm'de 2 dk santrifüj. Flow-through atın.
10. 200 ul sütun sütun engelleme tampon uygulayın ve 1000 rpm'de 2 dakika döndürün. Sütun dengelenmesi için bu adımı 4-5 kez tekrarlayın. ° C kullanana kadar Parafilm ile mühürlenmiş Sütunlar 4 saklanabilir.

3. Riboprobes Etiketlenmesi ve Arıtma

Detaylı, tek bir Spastine Özgü Riboprop üretim ve arıtma Aşağıda. DFISH için, her sonda hazırlık probların biotin etiketli UTP ile diğeri ise digoxigenin (DİJİTAL) etiketli UTP etiketli olacağını dışında, aynı metodoloji içerecektir.

1. Duygusu (kontrol) veya antisens riboprobes oluşturmak için bir ilgi konsantre (> 150 ng / ml) ve saflaştırılmış Lineerleştirilmiş cDNA çözüm hazırlayın.
2. 1.5 ml mikrofuge'de tüp, cDNA şablon, 5X prob etiketleme tampon 2 ul, 10X DIG 1 ul (veya biotin) etiketleme karışımı, RNasin 0.5 ul ve uygun RNA polimeraz 1 ul saflaştırılmış 0.5-1 mg eklemek ve son hacmi RNAse-free (DEPC tedavi) su ile 10 ul çözüm getirmek.
3. 37, bir su banyosu içinde çözüm ° C de 2 saat süreyle inkübe edin.
4. Çözüm ve sütun engelleme tampon 39 ul; tRNA 1 ul (20 mg / ml hisse senedi) ekleyin.
5. Prob arıtma Sephadex G50 sütun hazırlayın. Bu amaçla 50 ul engelleme tampon, sütun ekleyin ve 1000 rpm'de 10 saniye boyunca döndürün.
   Kolon (yani tam 50 ul sütuna uygulanan santrifüj döngüsü sonra kurtarıldı.) Dengelenmesi için bu adımı 2-3 kez tekrarlayın.
6. Sephadex G50 sütun, pozisyon, sütunun alt kısmında yeni bir mikrofuge'de tüp prob çözümü uygulayın ve saflaştırılmış 50 ul Spastine Özgü Riboprop çözüm elde etmek için 1000 rpm'de 3 dakika döndürün.
7. Ya bir standart formaldehit agaroz RNA jel, ya da bir spektrofotometre kullanarak etiketli Spastine Özgü Riboprop kalite ve verim değerlendirin.

4. Post-fiksasyon, Asetilasyon ve Hibritleşme

1. -80 ° C derin dondurucu bölümleri çıkartın ve oda sıcaklığına denge sağlaması için izin. Daha sonra, 5 dakika süreyle soğuk, taze% 3 paraformaldehid çözüm bölümler kuluçkaya yatmaktadır.
2. Kısaca p bölümleri durulamahosphate iki kez tamponlu salin (PBS).
3. Standart bir alkol serisi (70, 95, ve% 100, 2 dk) ile bölümleri, kurutmak ve hava kurumaya bırakın.
4. 10 dakika bir asetilasyonu çözüm bölümleri inkübe edin.
5. 2X SSPE bölümler 3 kez durulayın.
6. Yukarıda açıklanan standart alkol serisi ile tekrar bölümleri dehydrate ve onları kurumasını sağlar.
7. Hibridizasyon çözüm yeterli bir hacmi hazırlayın ve hem riboprobes çözüm (prob konsantrasyonu her probu için 1 ng / ml) ekleyin. Hibridizasyon çözüm toplam hacmi (hibridizasyon çözüm Bölüm başına 16 ul) melezleşmiştir bölümlerin sayısına göre belirlenir.
8. Herhangi bir hava kabarcıkları bindirme sağlayarak doku doku ve kapak slaytlara hibridizasyon çözüm yeterli hacim uygulayın.
9. Metal bir slayt tutucuya yerleştirin slaytlar. Daldırın tutucu bir mineral yağ banyosu içinde 65 ° C gece ayarlayın. Bu lamelleri (yani, slayt sahibinin lateral mineral yağ kabın alt kısmına temas edilmelidir) yukarı bakacak olun.

5. Post-Hibridizasyon yıkar

1. Ertesi gün, mineral yağ banyosu dikkatle slayt tutucu kaldırmak ve slaytlar kısaca aşırı yağ kaldırmak için kloroform durulayın.
2. Yer 2X SSPE çözümü için bir 5-10 dakika slaytlar. Lameller çözelti içinde iken slaytlar ayırmak gerekir.
3. Yeni bir 2X SSPE çözüm slaytları transferi ve 1 saat oda sıcaklığında saklayın.
4. 2X SSPE artı% 50 formamid içeren bir çözüm bölümleri aktarın. Bu çözümün sıcaklık gecelik hibridizasyon yöntemi kullanılan sıcaklık uyumlu olmalıdır. 1.5 saat süreyle bu çözüm slaytlar tutun.
5. 0.1x SSPE çözüm hibridizasyon adım aynı sıcaklıkta önceden ısıtılmış bölümler aktarın. 30 dakika için bu çözüm bölümleri inkübe edin. Ek bir 30 dakika için bu adımı tekrarlayın.

6. Riboprobes Algılama ve Görselleştirme

1. % 0.3 'lük hidrojen peroksit 10 dakika eklenmiştir TNT tampon Slaytları aktarın.
2. TNT tampon, 3 kez (10 dk) bölümleri yıkayın.
3. Bir DAKO kalem kullanarak, beynin bölümleri içeren alanı çevresinde iyi çizin. Daha da önemlisi, dikkatli bölümlere kuru değil sağlamak için dikkatli olunmalıdır.
4. Her bir slayt 150 ul TNB tampon uygulayın ve nemli bir odasında, bu çözüm bölümleri 30 dakika inkübe edin.
5. Devrilir slaytlar aşırı TNB çözüm çıkarın.
6. TNB çözüm 2 saat süreyle nemli odasında peroksidaz anti-DIG-konjuge antikor, ve mağaza slaytlar içeren 150 ul uygulayın. Antikor konsantrasyonu önce dFISH yürüten ilgi her transkript için ayrı ayrı tespit edilmelidir.
7. TNT tampon bölümleri yıkayın; 3 kez, her biri 10 dk.
8. Alexa her slayt için 594-konjuge tyramide çalışma çözeltisi 150 ul uygulayın ve 1 saat için nemli bir oda saklayabilirsiniz. Bu çözüm üretici yöne göre hazırlanmalıdır.
9. TNT tampon bölümleri yıkayın; 3 kez, her biri 10 dk.
10. - 30 dakika inkübe bölümleri TNT tampon hangi% 0.3 'lük hidrojen peroksit 10 eklendi olmuştur.
11. TNT tampon bölümleri yıkayın; 3 kez, her biri 10 dk.
12. Slayt başına 150 ul TNB tampon uygulayın ve 30 dakika için nemli bir oda tutmak.
13. Devrilir slaytlar aşırı TNB çözüm çıkarın.
14. TNB çözüm 2 saat süreyle nemli odasında peroksidaz-konjuge anti-biotin antikor, ve mağaza slaytlar içeren 150 ul ekleyin.
15. TNT tampon bölümleri yıkayın; 3 kez, her biri 10 dk.
16. Bir Alexa 150 ul 488-konjuge slaytlar ve 1 saat süreyle inkübe bölümleri tyramide çalışma çözümü uygulayın. Bu çözüm, üreticinin tavsiyelerine göre hazırlanmalıdır.
17. TNT tampon bölümleri yıkayın; 3 kez, her biri 10 dk.
18. Hoechst çözümü (TNT tampon 1:1000) 150 ul bölümlere ekleyin ve 2 dakika süreyle nemli odasına saklayın.
19. TNT tampon bölümlerin yıkayın; 3 kez, her biri 5 dakika.
20. Lamel bir floresan uyumlu montaj orta (örneğin, Vectashield veya antifade uzatmak) bölümleri.

7. Temsilcisi Sonuçlar

Şekil 1: Biz burada zebra ispinozu beyin elde temsilcisi dFISH sonuçlarını gösterir. Caudomedial nidopallium (NCM), memeli işitsel korteks Songbird analog elde fotomikrografı gösterilir. Beyin bölümleri parvalbumin (A), inhibitör nöronların alt nüfus için bir marker yöneltilen bir biotinlenmiş Spastine Özgü Riboprop melezleşmiştir ve Ribo DIG etiketliprob, şarkı odaklı nöronlar için güvenilir bir belirteç aktivite bağımlı gen zenk (B) karşı yöneltilmiş. C) (A) ve (B) işitsel deneyim ile aktive olan inhibitör nöronların bir nüfus gösterir Yerleşimi. Oklar ve ok uçları, her iki riboprobes özel etiketli hücreleri gösterir ve yıldızlarla ortak ilgi her iki transkript ifade temsilcisi nöronlar göstermektedir. Ölçek çubuğu = 25 mm.

Tartışmalar

Biz omurgalı beyin neurochemically ve işlevsel nasıl düzenlendiğini incelemek ve davranışsal ilgili duyusal uyaranlar etkisi, yetişkin ^beyin 8-10 nöronları genomik makine belirlemek için bu protokolü kullanılır . Biz başarılı, fare, sıçan ve ötücü beyin dokusu bu yöntem kullanılabilir, ancak bu protokol omurgalı türlerin bir dizi ve belki de, non-nöral dokuların elde edilen beyin bölümlerine kolayca adapte olacağını tahmin ediyoruz. Güvenilir sonuçlar ve en iyi sinyal elde e...

Malzemeler