骨骼肌的线粒体分离

摘要

这个协议描述一个过程来研究从骨骼肌中分离出的线粒体呼吸。这种方法改编自Scorrano等。（2007年）。线粒体的分离过程中需要约2小时。线粒体呼吸在大约1个小时就可以完成。

摘要

线粒体是细胞器控制细胞死亡的生命和。他们参与重要的代谢反应，合成的ATP，规范的信号^级联 2,3 。过去和目前研究人员已经从大鼠和小鼠的组织，如肝，脑^和心脏4,5中分离出线粒体。近年来，许多研究人员都集中在研究从骨骼肌线粒体功能。

在这里，我们描述了，我们已经成功地用于^从 6骨骼肌线粒体隔离的方法。我们的程序要求，所有的缓冲液和试剂都取得了新的和需要约250-500毫克骨骼肌。我们研究了从大鼠和小鼠腓肠肌和隔膜中分离出线粒体，鼠眼外肌。线粒体蛋白浓度测定Bradford法。重要的是保持在编制和功能的研究是一个相对较短的时间（约1小时）内进行线粒体样品冰冷。线粒体呼吸是用一个克拉克型电极（Oxygraph系统）在37 ° C ⁷极谱。氧电极的校准是在本议定书中的关键一步，它每天必须执行。隔离线粒体（150微克）被添加到实验缓冲液（EB）0.5毫升。国家2呼吸开始，除谷氨酸（5MM）和苹果酸（2.5毫米）。然后，二磷酸腺苷（ADP）（150微米）被添加到启动状态3。寡（1μM），ATP酶合成酶阻断剂，用于估计状态4。最后，羰基氰化物的P -三氟甲氧基] -苯基腙（FCCP，0.2微米）添加到measurestate 5，或耦合^呼吸 6 。呼吸控制率（RCR），状态3状态4的比例，计算后，每一个实验。 RCR≥4被认为是一个可行的线粒体准备的证据。

总之，我们目前的隔离，可用于生化（例如，研究酶的活性，免疫检测，蛋白质组学）和功能（线粒体呼吸）的骨骼肌线粒体可行的方法。

研究方案

1。缓冲区的制备

1. 开启离心机5804R，并设置为4 ° C。 Isotemp 3006D水浴，并设置转到37 ° C
2. 肌肉隔离前的准备以下解决方案：
   • PBS：磷酸盐缓冲液（PBS）药片溶解在蒸馏水（5片/升）。拌匀。
   • PBS加10 mM的EDTA：要准备100毫升溶液，添加98毫升的PBS 2毫升500毫米EDTA。
   • 8X线粒体缓冲液：蔗糖10.28克终浓度为0.6米，400毫克的自由脂肪酸的牛血清白蛋白（BSA）终浓度为0.8％，为160毫米的终浓度2.08克HEPES，pH值7.4和QS至50毫升，用蒸馏水。
   • 隔离缓冲1（IB1）：加入200μL500 mM的EDTA的终浓度为10毫米，0.392克终浓度为215毫米D -甘露醇，8X线粒体缓冲液，pH 1.25毫升至7.4和QS至10毫升，用蒸馏水。
   • 隔离缓冲2（IB2）：加入终浓度为3毫米，0.392克终浓度为215毫米D -甘露醇，8X线粒体缓冲液，pH 1.25毫升至7.4和QS 60至10μL500毫米EGTA毫升，用蒸馏水。
   • 实验缓冲液（EB）：加入终浓度为100μLMgCl _2的 500毫米的终浓度为5毫米，0.392克终浓度为215毫米D -甘露醇，25微升2.5毫米KH ₂ PO ₄ 6.25微米，2个100毫米EGTAμL终浓度为20微米，1.25毫升线粒体缓冲液，pH为7.4和QS至10毫升，用蒸馏水。

2。肌肉隔离

1. 在冰桶中，把3个10毫升的烧杯中，波特Elvehjem组织磨床和其他一切必要的仪器/用品上冰。整个实验过程中的一切都必须保持冰冷。
2. 放置在冰桶和温水浴​​EB IB1和IB2完成时的场所。
3. 在三个10毫升的烧杯中，应增加以下解决方案：
   • 烧杯1：10毫升的PBS
   • 烧杯2：10毫升的PBS / EDTA
   • 烧杯3：3毫升IB1
4. 杀死老鼠人道本地机构的动物护理和使用委员会批准。
5. 迅速隔离骨骼肌250-500毫克，在烧杯1冲洗，然后转移到烧杯2。

3。同质化/线粒体隔离

1. 肌肉转移到烧杯3和精细直言不讳地用剪刀肌肉。
2. 传输的解决方案，以波特Elvehjem匀浆。均质使用机动杵（一台钻床，会做的工作）的10倍，在任何时候都保持在冰管的肌肉。
3. 转移匀浆在700 克 10分钟，在4 ° C预冷的2毫升离心管和离心机
4. 上清转移到一个新的预冷的离心管。弃去沉淀。
5. 上清离心10分钟，在10500 克 ，4 ° C 。
6. 上清转移到一个新的预冷的离心管和标签SN1（上清1号）和肌肉类型。
7. 重悬在500μL的IB2颗粒。
8. 离心10分钟，在10500 克在4 ° C。
9. 上清转移到一个新的预冷的离心管和标签SN2（上清2）和肌肉类型。
10. 暂停在100μL的IB2最终线粒体颗粒。
11. 重新自旋最终线粒体悬浮在minifuge几秒钟。如果有颗粒，转移上清到一个新的预冷的离心管，弃去沉淀。
12. 确定蛋白浓度用Bradford检测^8。

4。电极校准

注：在线粒体隔离期间完成电极校准。

1. 加入100毫升蒸馏水至250毫升容量瓶中。大力搅拌20分钟，以平衡水与大气中的气体。
2. 添加几滴50％氯化钾Oxygraph电极。
3. 放置一个电极上的一小块蓝Rizla卷烟纸。
4. PTFE膜放置一块卷烟纸的顶部。
5. 申请使用环撒施，然后放置在电极槽外圈内圈。
6. 连接电极和组装其他设备：较大的塑料环基地，线粒体室，水管。
7. Oxygraph箱打开，并启动Oxygraph软件。
8. 平衡水线粒体室。
9. 搅拌棒和打开速度为60。
10. 开始一个新的实验。
11. 点击“校准”和液相校准框1。变温度至37 ° C，然后单击“确定”两次。
12. 当“覆盖”转变到“确定”点击它，打开氮气罐。
13. 广场一角相连氮气罐室，并建立零氧。点击“OK”时，从开关“覆盖。”
14. 吸干水和线粒体商会的EB缓冲液加入500μL。
15. 密封腔与柱塞。
16. 如果使用多个盒子，重复步骤11-15校准盒2。

5。线粒体呼吸

1. 开始一个新的实验，让它运行约1分钟，以稳定的信号。
2. 添加必要的线粒体悬液量（步长3.11），为150微克每一个分庭，标志事件，并让它运行1分钟。
3. 加入10μl的温暖250 mM/125 mM的谷氨酸/苹果酸终浓度为5 mM/2.5毫米。马克和让运行1分钟。这是定义为国家2。
4. 加入终浓度为150微米，马克7.5μL10 mM的ADP公司，并让运行了30秒。这被定义为国家3。
5. 添加另有10毫米ADP，马克7.5μL，让运行1.5分钟。
6. 加入终浓度为1微米，马克0.5μL冷10毫米寡，让运行3分钟。这被定义为国家4。
7. 加入终浓度为0.2微米，马克1μL0.1 mM的FCCP冷，让运行3分钟。这是定义为5国。
8. 完成后，结束实验，并保存。
9. 获取使用Oxygraph软件的呼吸速率。
10. 进入正常化的因素：如果添加150微克的线粒体蛋白，正常化的因素将是0.15。
11. 规范化呼吸率计算出不同的呼吸状态。
12. 计算除以3国4国的呼吸控制率（RCR）。

6。代表性的成果：

图1显示了一个代表骨骼肌线粒体消耗氧气的跟踪。电极信号稳定后，线粒体样品添加到Oxygraph室。国家2呼吸开始除了与谷氨酸和苹果酸。此外ADP的增加氧的消耗，定义状态3呼吸。 ATP合酶阻断寡此外，获得国家4呼吸。最后，FCCP添加到解耦线粒体呼吸（状态5）， 表1显示了国2，3，4和5代表氧的消耗率。呼吸控制率（RCR）是计算每个实验。 RCR≥4被认为是一个可行的线粒体准备的证据。

国家	归价格
状态2	34.74
状态3	153.40
国家4	16.49
国5	143.70
RCR	9.30

表1。线粒体呼吸速率。Representativeoxygen骨骼肌线粒体的消费率。值进行归一室线粒体的添加量。呼吸控制率（RCR），是由分裂状态3状态4。 RCR≥4代表一个可行的线粒体准备。

讨论

我们提出了一个协议孤立可行的骨骼肌线粒体。如果收益率是一个问题，该协议可以修改孵化5毫升30分钟，在冰PBS/10mM EDTA/0.01％胰蛋白酶的孤立肌肉。为了保证胰蛋白酶完成肌肉消化，肌肉需要充分剁碎。 PBS/10mM EDTA/0.01％胰蛋白酶溶液孵育30分钟后，必须完全取代隔离缓冲区1（IB1）3毫升。此外，使用胰蛋白酶，可能会干扰线粒体呼吸协议中的一些基板。这一协议处于良好的使用胰蛋白酶时线粒?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% CO2 / 5% O2 mix	Local Gas Supplier
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	A2754
Blue Rizla Paper	Hansatech	890101
Bradford protein assay	Bio-Rad	500-0006
Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Centrifuge 5804R	Eppendorf
Compressed nitrogen	Local Gas Supplier
D-mannitol	Sigma-Aldrich	M9647
Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Bio-Rad	161-0728
Free fatty acid bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A8806
Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G5889
HEPES sodium salt	Sigma-Aldrich	H7006
Isotemp 3006D	Fisher Scientific
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Male Sprague Dawley Rats	Harlan Laboratories	300-500g
Malic acid	Sigma-Aldrich	M9138
Minifuge	ISC Bioexpress	C1301P
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876
Oxygen electrode disc	Hansatech	S1
Oxygraph	Hansatech
Oxygraph Plus V1.01 Software	Hansatech
pH-meter	Mettler Toledo	1225506149
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P8416
Potter-Elvehjem homogenizers	Fisher Scientific	08-414-14A
PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane	Hansatech	S4
SKIL 3320 drill press	Hardware store
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016