骨格筋からのミトコンドリア単離

要約

このプロトコルは、骨格筋から単離したミトコンドリアの呼吸を研究するための手順を説明します。このメソッドは、Scorranoから翻案されましたら。（2007）。ミトコンドリアの単離方法は、約2時間を必要とします。ミトコンドリア呼吸は約1時間で完了することができます。

要約

ミトコンドリア細胞の生と死を制御する細胞内小器官です。彼らは、主要な代謝反応に関与ATPの大部分を合成し、カスケード^2,3をシグナリングの数を調整する。過去と現在の研究者は、肝臓、脳や心臓^4,5としてラットやマウスの組織から単離ミトコンドリアいる。近年、多くの研究者は、骨格筋のミトコンドリア機能の研究に焦点を当てている。

ここで、我々は骨格筋⁶からミトコンドリアを単離するために正常に使用した方法を説明します。この場合の手続きは、すべてのバッファーと試薬が新鮮作られ、骨格筋の250から500まで約100mgを必要している必要があります。我々は、ラットとマウス腓腹筋と横隔膜から単離したミトコンドリアを研究し、ラットの眼の筋肉。ミトコンドリアタンパク質濃度はBradfordアッセイで測定されます。それは、ミトコンドリアのサンプルが準備中に氷冷状態に保つことと機能に関する研究が比較的短い時間（〜1時間）以内に測定することが重要です。ミトコンドリア呼吸は37クラーク型電極（Oxygraphシステム）° C ⁷でポーラログラフ分析を用いて測定されます。酸素電極のキャリブレーションは、このプロトコルの重要なステップであり、それを毎日実行する必要があります。単離ミトコンドリア（150μg）を実験的バッファー（EB）の0.5mlに追加されます。状態2呼吸は、グルタミン酸の添加（5mMの）とリンゴ酸（2.5 mM）で始まります。その後、アデノシン二リン酸（ADP）（150μM）は状態3を起動するために追加されます。オリゴマイシン（1μM）、ATPアーゼの酵素ブロッカーは、状態4を推定するために使用されます。最後に、カルボニルシアニドp型[トリフルオロメトキシが] -フェニル-ヒドラゾン（FCCP、0.2μM）は5 measurestateに追加、または呼吸⁶非結合される。呼吸調節率（RCR）、状態4から状態3の比率は、各実験後に計算されます。 RCR≥4は、実行可能なミトコンドリアの準備の証拠として考えられている。

要約すると、我々は、生化学的（例えば、酵素活性、免疫、プロテオミクス）と機能に関する研究（ミトコンドリア呼吸）で使用することができる骨格筋から実行可能なミトコンドリアの単離のための方法を提示する。

プロトコル

1。バッファーの調製

1. 遠心5804Rの電源を入れ、4℃に設定37℃にIsotemp 3006D水浴とセットの電源を入れ
2. 筋肉の分離の前に以下のソリューションを準備します。
   • PBS：蒸留水（5粒/リットル）にリン酸緩衝生理食塩水（PBS）タブレットを溶かす。よく混ぜる。
   • PBSを加えた10mMのEDTA：100mlの溶液を調製するためには、PBSの98 mlに500 mMのEDTAの2 mlを加える。
   • 8Xミトコンドリアバッファー：0.6 Mの最終濃度のスクロース10.28グラム、遊離脂肪酸の400mgのウシ血清アルブミン（BSA）0.8％、160 mMの最終濃度のためのHEPESの2.08グラム、pHの最終濃度蒸留水で50mlに7.4〜とQS。
   • 絶縁バッファ1（IB1は）：10に、215 mMの最終濃度のD -マンニトールの0.392グラム、最終濃度10 mM、500 mMのEDTA 200μlを加え8Xミトコンドリアバッファの1.25ミリリットル、7.4のpHとQS蒸留水とを添加した。
   • 絶縁バッファ2（IB2は）：10に、215 mMの最終濃度のD -マンニトールの0.392グラム、3 mMの最終濃度は500 mMのEGTAの60μlを加え8Xミトコンドリアバッファの1.25ミリリットル、7.4のpHとQS蒸留水とを添加した。
   • 実験的なバッファー（EB）：の最終濃度2.5mMのKH ₂ PO ₄を25μl、215 mMの最終濃度のD -マンニトールの0.392グラム、5 mMの最終濃度を500 mMのMgCl ₂の100μlを追加する6.25μM、20μMの最終濃度を100 mMのEGTAを2μl、ミトコンドリアの緩衝液、pH7.4にし、QS蒸留水で10mlまでの1.25ミリリットル。

2。筋肉のアイソレーション

1. アイスバケットでは、3つの10 mlのビーカー、ポッター-エルベージェム組織グラインダーと氷の上の楽器/消耗品その他のすべての必要を置く。すべては、実験を通して氷冷滞在する必要があります。
2. 行って温水槽でアイスバケットとEBのIB1とIB2を置きます。
3. three 10ミリリットルのビーカーでは、以下のソリューションを追加する必要があります。
   • ビーカー1：PBSを10ml
   • ビーカー2：PBS / EDTAを10ml
   • ビーカー3：IB1 3 mlの
4. 人道的としてローカルの動物実験使用の委員会によって承認されたラットを殺す。
5. 急速に、骨格筋の250から500ミリグラムを分離ビーカー1で洗い流した後、ビーカー2に転送します。

3。均質化/ミトコンドリア単離

1. ビーカー3に筋肉を移し、細かくはさみで筋肉を飾らない。
2. ポッター-エルベージェムホモジナイザーに解決策を転送する。電動乳棒（ドリルプレスの仕事をする）すべての回で氷の中にチューブを保持する10回を使って筋肉をホモジナイズする。
3. 4℃で10分間、700 グラム ℃であらかじめ冷却した2 mlのマイクロチューブや遠沈管にホモジネート転送
4. 新しい冷却した新しいマイクロチューブに上清を移す。ペレットを捨てる。
5. 4℃で10分間、10500 グラムで上清を遠心℃に
6. 新しい冷却した新しいマイクロチューブやラベルのSN1（清番号1）と筋肉の種類に上清を移す。
7. IB2500μlにペレットを再懸濁する。
8. 4℃で10分間、10500 グラムで遠心℃、
9. 新しい冷却した新しいマイクロチューブやラベルのSN2（清番号2）と筋肉の種類に上清を移します。
10. IB2の100μlの最終的なミトコンドリアペレットを中断します。
11. 数秒間minifugeのリスピン最終ミトコンドリア懸濁液。ペレットがある場合は、新しい冷却した新しいマイクロチューブに上清を移すと、ペレットを捨てる。
12. ブラッドフォードアッセイ^8を使用してタンパク質濃度を決定する。

4。電極のキャリブレーション

注：ミトコンドリア分離時の完全な電極のキャリブレーション。

1. 250mlのフラスコに100mlの蒸留水を追加。大気中のガスと水を平衡化し、20分間激しく攪拌。
2. Oxygraph電極にKClを50％の数滴を追加します。
3. 電極の上にブルーリズラ圧延紙の小片を置きます。
4. ローリングペーパーの上にPTFEの膜の一部を置きます。
5. リングのアプリケーターを用いて内輪を適用し、電極の溝に外輪を置きます。
6. 電極を接続し、機器の残りのアセンブル：大きなプラスチック製のリングのベース、ミトコンドリア室、および水のホースを。
7. Oxygraphボックスをオンにし、Oxygraphのソフトウェアを起動します。
8. ミトコンドリア室に平衡水を追加。
9. 攪拌棒を、60の速度にオン追加。
10. 新しい実験を始める。
11. キャリブレーションをクリックし、ボックス1の液相のキャリブレーション。温度を37に変更° Cと"OK"を2回クリックします。
12. "OK"と"上書き"の変更は、それをクリックし、窒素ガスのタンクを開くと。
13. 接続されている場所のヒントチャンバー内に窒素タンクへとゼロ酸素を確立する。それが切り替わる時、"OK"をクリックして"上書き。"
14. 水を吸引し、ミトコンドリアのチャンバーへのEB緩衝液500μlを加える。
15. プランジ​​ャーとシールチャンバー。
16. ボックス2のキャリブレーションのため11月15日、複数のボックスは、手順を使用している場合。

5。ミトコンドリア呼吸

1. 新しい実験を開始し、その信号を安定させるために約1分間実行してみましょう。
2. 各チャンバーに150μgのためにミトコンドリア懸濁液（ステップ3.11）の必要量、マークイベントを追加し、それが1分間実行してみましょう。
3. 5 mM/2.5 mMの最終濃度のウォーム250 mM/125 mMのグルタミン酸/リンゴ酸を10μlを添加します。マークし、1分間実行してみましょう。これは、状態2のように定義されます。
4. -150μMの最終濃度10 mMのADP7.5μlの、マークを、追加し、30秒間実行してみましょう。これは状態3と定義されています。
5. 10 mMのADP、マークの別の7.5μlのを追加し、1.5分間実行してみましょう。
6. 1μM、マークの最終濃度のために冷10 mMのオリゴマイシンの0.5μlを加え、3分間実行してみましょう。これは、状態4のように定義されます。
7. 0.2μM、マークの最終濃度のコールド0.1mMのFCCPの1μlを加え、3分間実行してみましょう。これは、状態5として定義されています。
8. 終了したら、実験を終了して保存する。
9. Oxygraphソフトウェアを使用して呼吸速度を取得する。
10. 正規化係数を入力してください：ミトコンドリアタンパク質150μgを添加すると、正規化係数は0.15となります。
11. さまざまな呼吸状態のために正規化された呼吸速度を計算する。
12. 状態4によって状態3で割って呼吸調節率（RCR）を計算する。

6。代表的な結果：

図1は、。ミトコンドリア骨格筋での酸素消費量のトレース代表を示しています。電極信号が安定した後、ミトコンドリアサンプルはOxygraph室に追加されます。状態2呼吸は、グルタミン酸とリンゴ酸の添加により開始されます。 ADPの添加は、状態3呼吸を定義する、酸素消費量を増加させる。 ATP合成酵素は、状態4呼吸を得るためにオリゴマイシンを添加することによってブロックされます。最後に、FCCPはミトコンドリア呼吸（状態5）を切り離すために追加されます。 表1は、状態2、3、4、5の代表的酸素消費率を示しています。呼吸調節率（RCR）は、それぞれの実験のために計算されます。 RCR≥4は、実行可能なミトコンドリアの準備の証拠として考えられている。

国	正規化されたレート
状態2	34.74
状態3	153.40
状態4	16.49
状態5	143.70
RCR	9.30

表1。ミトコンドリア呼吸速度。ミトコンドリア骨格筋からRepresentativeoxygen消費率。値は、チャンバーに追加されたミトコンドリアの量に正規化されます。呼吸調節率（RCR）が状態4によって状態3で割ることによって決定されます。 RCR≥4は、実行可能なミトコンドリアの準備を表します。

ディスカッション

我々は、骨格筋から実行可能なミトコンドリアを分離するためのプロトコルを提示する。歩留まりに問題がある場合、プロトコルは氷中で30分間PBS/10mM EDTA/0.01％のトリプシン5mlに分離された筋肉をインキュベートすることによって変更することができます。トリプシンとの完全な筋肉の消化を確保するために、筋肉は完全にみじん切りする必要があります。 30分間のインキュベーション後、PB...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% CO2 / 5% O2 mix	Local Gas Supplier
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	A2754
Blue Rizla Paper	Hansatech	890101
Bradford protein assay	Bio-Rad	500-0006
Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Centrifuge 5804R	Eppendorf
Compressed nitrogen	Local Gas Supplier
D-mannitol	Sigma-Aldrich	M9647
Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Bio-Rad	161-0728
Free fatty acid bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A8806
Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G5889
HEPES sodium salt	Sigma-Aldrich	H7006
Isotemp 3006D	Fisher Scientific
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Male Sprague Dawley Rats	Harlan Laboratories	300-500g
Malic acid	Sigma-Aldrich	M9138
Minifuge	ISC Bioexpress	C1301P
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876
Oxygen electrode disc	Hansatech	S1
Oxygraph	Hansatech
Oxygraph Plus V1.01 Software	Hansatech
pH-meter	Mettler Toledo	1225506149
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P8416
Potter-Elvehjem homogenizers	Fisher Scientific	08-414-14A
PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane	Hansatech	S4
SKIL 3320 drill press	Hardware store
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016