Митохондриальная Изоляция от скелетных мышц

Резюме

Этот протокол описывает процедуры для изучения дыхания митохондрии, выделенные из скелетных мышц. Этот метод был заимствован из Scorrano Соавт. (2007). Митохондриальной процедуры изоляции требуется около 2 часов. Митохондриального дыхания может быть завершена в 1 час.

Аннотация

Митохондрии являются органеллами управления жизнью и смертью клетки. Они участвуют в основных метаболических реакций, синтезировать большинство из АТФ, и регулировать число сигнальных каскадов ^2,3. Прошлые и текущие исследователи выделили митохондрии от крыс и мышей тканей, таких как печень, мозг и сердце ^4,5. В последние годы многие исследователи сосредоточились на изучении функции митохондрий из скелетных мышц.

Здесь мы опишем метод, который мы успешно используется для выделения митохондрий из скелетных мышц ^6. Наша процедура требует, чтобы все буферы и реагенты производятся свежими и нужно около 250-500 мг скелетных мышц. Мы изучали митохондрии, выделенные из крыс и мышей икроножной мышцы и диафрагма и мышцы крысы экстраокулярных. Митохондриальная концентрации белка измеряется с помощью анализа Брэдфорда. Важно, что митохондриальная образцы хранятся ледяной во время подготовки и функциональных исследований, что быть выполнена в течение относительно короткого времени (~ 1 час). Митохондриальная дыхания измеряется с помощью полярографии с Кларком типа электрода (Oxygraph системы) при температуре 37 ° C ^7. Калибровка кислородного электрода является ключевым шагом в этом протоколе, и оно должно быть исполнено в день. Изолированные митохондрии (150 мкг) добавляют к 0,5 мл экспериментальных буфера (ИС). Состояние 2 дыхания начинается с того глутамата (5мм) и малат (2,5 мм). Затем, аденозин дифосфат (АДФ) (150 мкм) добавляется в начальное состояние 3. Олигомицин (1 мкМ), блокатор АТФазы синтазы, используется для оценки состояния 4. Наконец, карбонильные цианида р-[трифторметокси]-фенил-гидразона (FCCP, 0,2 мкМ) добавляется к measurestate 5, или несвязанных дыхания ^6. Дыхательный коэффициент (РКП), отношение государственного 3 до состояния 4, рассчитывается после каждого эксперимента. RCR ≥ 4 рассматривается как свидетельство жизнеспособных митохондрий подготовки.

Таким образом, мы представляем метод выделения жизнеспособных митохондрий скелетных мышц, которые можно использовать в биохимических (например, активность ферментов, иммунодетекции, протеомика) и функциональные исследования (митохондриального дыхания).

протокол

1. Подготовка буферов

1. Включите центрифуги 5804R и установить до 4 ° C. Включите Isotemp 3006D водяную баню и установить до 37 ° C.
2. Подготовьте следующие решения до мышц изоляции:
   • PBS: Растворите фосфатным буферным раствором (PBS) таблетки в дистиллированной воде (5 таблеток / литр). Хорошо перемешайте.
   • ФСБ, содержащего 10 мМ ЭДТА: подготовить 100 мл раствора, добавляют 2 мл 500 мМ ЭДТА до 98 мл PBS.
   • 8X Митохондрии буфера: 10,28 г сахарозы для конечной концентрации 0,6 М, 400 мг свободных жирных кислот бычьего сывороточного альбумина (БСА) в конечной концентрации 0,8%, 2,08 г HEPES для конечной концентрации 160 мМ, рН до 7,4 и QS до 50 мл дистиллированной воды.
   • Изоляция буфера 1 (IB1): Добавить 200 мкл 500 мМ ЭДТА для конечной концентрации 10 мМ, 0,392 г D-маннита для конечной концентрации 215 мМ, 1,25 мл 8X митохондрий буфере, рН до 7,4 и до 10 QS мл дистиллированной водой.
   • Изоляция буфера 2 (IB2): Добавьте 60 мкл 500 мМ EGTA для конечной концентрации 3 мМ, 0,392 г D-маннита для конечной концентрации 215 мМ, 1,25 мл 8X митохондрий буфере, рН до 7,4 и до 10 QS мл дистиллированной водой.
   • Экспериментальные буфера (EB): Добавить 100 мкл 500 мМ MgCl ₂ для конечной концентрации 5 мМ, 0,392 г D-маннита для конечной концентрации 215 мМ, 25 мкл 2,5 мМ KH ₂ PO ₄ для конечной концентрации 6,25 мкм, 2 мкл 100 мМ EGTA для конечной концентрации 20 мкМ, 1,25 мл митохондриальной буфере, рН до 7,4 и QS до 10 мл дистиллированной воды.

2. Мышцы Изоляция

1. В ведерко со льдом, положить три 10 мл стаканы, Поттер-Elvehjem шлифовальные ткани и все другие необходимые инструменты / поставок на льду. Все должно оставаться ледяной течение всего эксперимента.
2. Место IB1 и IB2 в ведро льда и EB в теплой ванне, когда закончите.
3. В трех 10 мл стаканы, следующие решения должны быть добавлены:
   • Стакан 1: 10 мл PBS
   • Стакан 2: 10 мл PBS / ЭДТА
   • Стакан 3: 3 мл IB1
4. Убийство крысы гуманно утвержденной локальной институциональной уходу и использованию животных комитета.
5. Быстро изолировать 250-500 мг скелетных мышц, промыть в Стакан 1, то трансфер в Стакан 2.

3. Гомогенизация / Митохондриальная Изоляция

1. Передача мышцы Стакан 3 и мелко рубят мышц с помощью ножниц.
2. Передача решение Поттер-Elvehjem гомогенизатора. Однородный мышцы с использованием моторизованных пестиком (сверлильный станок будет делать эту работу) 10 раз соответствии трубки во льду во все времена.
3. Передача гомогената предварительно охлажденное 2 мл микроцентрифужных труб и центрифуге при 700 г в течение 10 минут при 4 ° C.
4. Передача супернатант в новую предварительно охлажденное микроцентрифужных трубки. Отменить гранул.
5. Центрифуга супернатант в 10500 г в течение 10 минут при 4 ° C.
6. Передача супернатант в новую предварительно охлажденной трубки микроцентрифужных и этикетки SN1 (супернатанта № 1) и мышечного типа.
7. Повторное приостановить гранул в 500 мкл IB2.
8. Центрифуга на 10 500 г в течение 10 минут при 4 ° C.
9. Передача супернатант в новую предварительно охлажденной трубки микроцентрифужных и этикетки SN2 (супернатанта № 2) и мышечного типа.
10. Приостановить окончательного митохондриальные гранулы в 100 мкл IB2.
11. Re-спинового окончательного митохондриальной суспензии в minifuge за несколько секунд. Если есть шарик, передача супернатант в новую предварительно охлажденное микроцентрифужных трубки и отбросить гранул.
12. Определение концентрации белка использованием анализа Брэдфорда ^8.

4. Электрод калибровки

ПРИМЕЧАНИЕ: Полный калибровки электрода во время митохондриальной изоляции.

1. Добавить 100 мл дистиллированной воды до 250 мл колбу. Перемешать энергично в течение 20 минут, чтобы уравновесить воды с атмосферным газом.
2. Добавить несколько капель 50% KCl на Oxygraph электрода.
3. Место небольшой кусочек синий Rizla прокатки бумаги поверх электрода.
4. Место кусок мембраны PTFE на вершине прокатки бумаги.
5. Применить внутреннее кольцо с помощью кольца аппликатором, а затем поместить внешнего кольца в паз электрода.
6. Подключите электроды и собрать остальное оборудование: большие пластиковые кольца основания, митохондриальная камеры и водяные шланги.
7. Включите Oxygraph коробки и начать Oxygraph программного обеспечения.
8. Добавить уравновешенной воды митохондриальной камеры.
9. Добавить мешалкой и повернуть на скорости 60.
10. Начало нового эксперимента.
11. Нажмите на калибровку и затем жидкость калибровки фазы для вставке 1. Изменение температуры до 37 ° C и нажмите "ОК" два раза.
12. Когда "Override" меняется на "ОК", выберите его и открыть резервуар азота.
13. Место наконечник подключен к азота резервуара в камеру и установить нулевой кислорода. Cлизать "OK", когда оно переходит из "Override".
14. Аспирируйте воды и добавить 500 мкл буфера EB для митохондриальных камер.
15. Печать камеру с поршнем.
16. Если вы используете несколько ящиков, повторите шаги 11-15 для калибровки вставке 2.

5. Митохондриального дыхания

1. Начало нового эксперимента, дайте ему поработать в течение приблизительно 1 минуты, чтобы стабилизировать сигнал.
2. Добавить необходимого объема митохондриального подвески (шаг 3,11) на 150 мкг в каждой камере, отмечают событие, и дайте ему поработать в течение 1 минуты.
3. Добавьте 10 мкл теплой 250 mM/125 мМ глутамат / малат для конечной концентрации 5 мМ mM/2.5. Марк и давайте работать в течение 1 минуты. Это определено как состояние 2.
4. Добавить 7,5 мкл 10 мМ АДФ для конечной концентрации 150 мкМ, знак, и пусть запустить в течение 30 секунд. Это определено как состояние 3.
5. Добавить еще 7,5 мкл 10 мМ АДФ, знак, и пусть баллотироваться на 1,5 минуты.
6. Добавить 0,5 мкл холодного 10 мМ олигомицину для конечной концентрации 1 мкМ, знак, и пусть баллотироваться на 3 минуты. Это определено как состояние 4.
7. Добавить 1 мкл холодного 0,1 ммоль FCCP для конечной концентрации 0,2 мкМ, знак, и пусть баллотироваться на 3 минуты. Это определено как состояние 5.
8. По окончании эксперимента конца и сохранить.
9. Приобретать дыхания ставки использованием Oxygraph программного обеспечения.
10. Введите нормализации фактор: если добавление 150 мкг митохондриальных белков, нормализации коэффициент будет 0,15.
11. Рассчитать нормированные ставки дыхания для различных состояний дыхания.
12. Рассчитать дыхательный коэффициент (РКП), путем деления государства 3 к государству 4.

6. Представитель Результаты:

Рисунок 1. Показывает, представитель отслеживание потребления кислорода скелетных мышц митохондриями. После электрода сигнал стабилизируется, митохондрии образец добавляется в камере Oxygraph. Состояние 2 дыхания начинается с того глутамата и малата. Добавление АДФ увеличивает потребление кислорода, определяющие состояние 3 дыхания. АТФ-синтазы блокируется добавлением олигомицину получить состояние 4 дыхания. Наконец, FCCP добавляется разъединять митохондриального дыхания (состояние 5). В таблице 1 приведены представитель ставки потребление кислорода на 2 государства, 3, 4 и 5. Дыхательный коэффициент (РКП) рассчитывается для каждого эксперимента. RCR ≥ 4 рассматривается как свидетельство жизнеспособных митохондрий подготовки.

Государства	Нормализованные цены
Состояние 2	34,74
Состояние 3	153,40
Состояние 4	16,49
Государство 5	143,70
RCR	9,30

Таблица 1. Митохондриальная ставки дыхания. Representativeoxygen нормы потребления из скелетных мышц митохондриями. Значения нормированы на количество митохондрий добавляется в камере. Дыхательный коэффициент (РКП), определяется путем деления состояние 3 государственными 4. RCR ≥ 4 представляет собой реальную митохондрий подготовки.

Обсуждение

Мы представляем протокол, чтобы изолировать жизнеспособных митохондрий скелетных мышц. Если выход проблему, протокол может быть изменен путем инкубации изолированной мышцы в 5 мл PBS/10mM EDTA/0.01% трипсина в течение 30 минут во льду. Для обеспечения полного переваривания мышц трипсином, мышц?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
95% CO2 / 5% O2 mix	Local Gas Supplier
Adenosine 5′-diphosphate sodium salt	Sigma-Aldrich	A2754
Blue Rizla Paper	Hansatech	890101
Bradford protein assay	Bio-Rad	500-0006
Carbonylcyanide p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP)	Sigma-Aldrich	C2920
Centrifuge 5804R	Eppendorf
Compressed nitrogen	Local Gas Supplier
D-mannitol	Sigma-Aldrich	M9647
Ethlyene-glycol-bis-tetraacetic acid (EGTA)	Sigma-Aldrich	E3889
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Bio-Rad	161-0728
Free fatty acid bovine serum albumin	Sigma-Aldrich	A8806
Glutamic acid	Sigma-Aldrich	G5889
HEPES sodium salt	Sigma-Aldrich	H7006
Isotemp 3006D	Fisher Scientific
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Male Sprague Dawley Rats	Harlan Laboratories	300-500g
Malic acid	Sigma-Aldrich	M9138
Minifuge	ISC Bioexpress	C1301P
Oligomycin	Sigma-Aldrich	O4876
Oxygen electrode disc	Hansatech	S1
Oxygraph	Hansatech
Oxygraph Plus V1.01 Software	Hansatech
pH-meter	Mettler Toledo	1225506149
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4417
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P3911
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	P8416
Potter-Elvehjem homogenizers	Fisher Scientific	08-414-14A
PTFE (0.0125mm × 25mm) membrane	Hansatech	S4
SKIL 3320 drill press	Hardware store
Sucrose	Sigma-Aldrich	S5016