检测采用ELISA法的母语完整的核小体的翻译后修饰

摘要

核小体酶联免疫吸附（NU - ELISA法）是一个敏感的和定量的方法来检测翻译后修饰的全球格局，本土的，完整的核小体的筹备工作。这些修改包括甲基化，acetylations，以及在特定的组蛋白的氨基酸残基的磷酸化，因此NU - ELISA法提供了一个全球性的整体染色修改国家特定的细胞类型的蛋白质组检测。

摘要

真核生物的基因组中存在其中包含的DNA和蛋白质的染色。染色质的基本单位是核小体，其中包含146个DNA碱基对与两个组蛋白H2A，H2B，H3和^H4 1相关的。组蛋白的N -末端尾巴中含有丰富的赖氨酸和精氨酸和转录后进行修改，经乙酰化，甲基化和其他翻译后修饰（PTMS）。 PTM的核小体配置会影响相关的DNA的转录活性，从 ​​而提供了一种基因调控的模式，是^在自然界2,3后生。我们开发了一个方法叫做核小体酶联免疫吸附（NU - ELISA）定量测定，从细胞中提取的核小体的全球的PTM签名。 NU - ELISA法更为敏感和免疫印迹定量，并询问epiproteomic国家特定的细胞类型是有用的。此视频杂志文章显示详细程序执行NU - ELISA法分析。

研究方案

1。哺乳动物细胞培养

NU - ELISA法可以在任何可以在培养的哺乳动物细胞类型。我们宁愿准备适度大批量的细胞，使核小体可以在足够数量的隔离准备几个相同加载的酶标板，从而使与几个不同的抗体（ABS）的检测。下面的文化尺度提供了充足的材料：

对于小鼠embyronic的干细胞，无饲养层细胞生长的细胞的一个或两个15厘米板。对于成纤维细胞，生长5年至10 15厘米板汇合。

2。原子核的隔离

注：所有步骤都是冰预冷的缓冲，除特别说明外。

1. Trypsinize细胞，每盘用3 ml胰蛋白酶结合，并添加20毫升的冰冷的PBS /丁酸。离心5分钟1000转。
2. 重悬细胞于10 ml PBS /丁酸和离心5分钟1000转。
3. 悬浮在与蛋白酶抑制剂（Sigma - Aldrich公司的P - 8340）的细胞裂解液4毫升。 Dounce均质型碓冰乙20招。
4. 在2000克离心10分钟，在4 ° C。 （上清含有细胞质，这是不是本议定书所需要的，但如果需要的话，可以作其他用途，保存）。
5. 悬浮颗粒在2毫升冰冷洗缓冲液C（蛋白酶抑制剂）。
6. 层超过500毫升30％的蔗糖垫的悬浮物质，然后在2400克离心5分钟在一个水平转头。原子核会迁移，通过垫，接口仍然碎片。
7. 仔细删除所有液体的体积和重悬在250μL冰冷的缓冲液洗的C +蛋白酶抑制剂的原子核。

3。核小体的分离在原位微球菌核酸（MNase）消化

我们使用在其中染色质内的细胞核注入与MNase，由低渗处理上清液，从而推动了免费的完整的核小体原位消化的过程。

1. 3μL0.1 M的_氯化钙样品。放置在37℃加热块。允许承担37 ° C的温度。
2. 新增2台MNase（Sigma - Aldrich公司，微球菌核酸，溶解于2units/10μlMNase缓冲区），然后在37 ° C为12分钟，经常混合使用吸管尖。
3. 加入6μL0.5 M的Na - EDTA，pH值8.0，停止反应。置于冰上。
4. 在2000克离心4分钟，弃上清。 300μL0.2毫米的Na - EDTA重悬沉淀。存放在冰与偶尔的温柔pipeting 1小时。 （这些低渗条件，从原子核中解放出来的自由核小体）。
5. 离心4分钟3000克，在4 ° C。保存上清，其中包含了免费的核小体，在冰上。
6. 悬浮颗粒再次与300μL0.2毫米的Na - EDTA。存放在冰与偶尔的温柔pipeting 1小时。
7. 离心4分钟3000克在4 ° C。保留上清，结合起来，从第5步上清。造成mononucleosome准备可以分装和储存在-80 ° C

注：染色质量可以粗略地通过测量10μL样品在260 nm处的吸光度定量加入到990μL水。 ₂₆₀ = 10（后调整为1 / 100稀释），相当于约染色1mg/ml的。此外，在上述过程中，小样本可能被保留，并为他们的DNA含量分析后监察MNase消化，这主要应包含长度为146 bp的DNA的质量和程度。阶梯是MNase消化不全的指标。

注：图1包含一个核隔离和MNase消化步骤图解摘要。

4。核小体，ELISA（NU - ELISA法）

我们发现含有本机已在96孔酶标微孔板固定完好nuclesosomes分数PTMS。对于每个样本，我们做了一系列的2倍稀释，这些都是到涂井一式三份。

1. 在4 ° 50μL/孔的核小体在涂料缓冲稀释过夜大衣MaxiSorp板建议核小体的序列双重稀释准备从最上面一行的底部行中加入0.1微克，0.05微克，0.025微克，0.0125微克，0.00625微克，0.00313微克，0.00156微克，与涂层的缓冲区，只有在底部（0微克染色）行。 （注：板盖都需要这一步。）
2. 当天上午，洗板200μL/ PBS/0.5％吐温20在室温（RT）的总和为10分钟用洗板机的4倍。
3. 座在室温下1小时与100μL/ PBS/0.05％吐温20 / 5％牛血清白蛋白。
4. 删除轻快地摇晃倒板封闭液在一个水槽。盖上盖子，并储存在-20 ° C的板，或直接进入下一步。
5. 1 · ABS添加量在50μL/ 1:1000以及稀释PBS/0.05％吐温20 / 5％BSA，室温下孵育1小时一个肩（或需要）。
6. 洗净板200μL/ PBS/0.5％吐温20在室温下，在洗板的总和为10分钟的4倍。
7. 加入辣根过氧化物酶（HRP）的共轭2 ° ABS，PBS/0.05％吐温20 / 5％BSA室温下一个小时一个肩稀释1:5000（或需要）。
8. 洗净板与200μL/孔PBS/0.5％Tween - 20的4倍。每次清洗用洗板机在室温下，共10分钟。
9. 在室温为10分钟，加入50μLTMB底物，每口井的开发板。加入50μL/孔的2N H ₂ SO _4，停止反应，450 nm处读取的板块。 （提示：2分钟1500转的离心机，使用一盘转子任何气泡​​消散在井前读取吸光度）。
10. 读数导出到电子表格文件，定量和统计分析。

试剂

PBS /丁酸

135 mM氯化钠

2.5 mM的氯化钾

8毫米的Na 2 HPO 4

1.5毫米KH 2 PO 4

10毫米钠丁酸

裂解液

250毫米蔗糖

10毫米的Tris - HCl，pH值7.4

10毫米钠丁酸

4毫米氯化镁2

0.1％的Triton X - 100

洗缓冲液C

250毫米蔗糖

10毫米的Tris - HCl，pH值7.4

10毫米钠丁酸

4毫米氯化镁2

蔗糖垫

30％（W / V）蔗糖在洗涤缓冲液C

Microccocal核酸缓冲器

5毫米NAPO 4缓冲液，pH值7.0

0.025毫米氯化钙2

涂料缓冲区

80毫升溶液A +170毫升解决方案的B +250毫升生署2 O

溶液A：0.2 M NA 2 CO 3

B液：0.2 M碳酸氢钠3

5。代表性的成果

使用NU - ELISA检测方法，准备与染色质的mononucleosomes形式编写的，它可以载入多个相同的板系列。我们通常会准备一系列的相同装板，使每个人都可以用不同的反PTM（ABS）的特异性抗体探测。我们也随时准备与组蛋白抗体，检测，而不考虑其修改状态总染色质负荷控制，可探测的一个板块。这种控制是必不可少的，为了以后定量PTM的内容从不同的样品制备的核小体进行比较。在一个给定的染色质样品进行定量PTMS的水平，我们正确的原始吸光度值，使用这种方法：首先，我们使用不包含染色质（背景通常是可以忽略不计）从控制井获得的值减去任何背景信号。然后，我们规范的PTM -特定的信号相同装板与独立对其进行修改状态检测核小体的AB检测所得的NU - ELISA法检测的结果。 （我们用于此目的的组蛋白H2A或H2B多克隆ABS）。然后，我们决定为每个稀释的染色质的均值和方差，并用ELISA法检测的线性部分获得的数据。 NU - ELISA法的数学和统计分析的详细的例子有报道^先前 4

图1。 NU - ELISA的步骤示意图diagam。 A.哺乳动物细胞的收获; B.细胞核从细胞中分离Dounce homogenization，C.扰乱细胞的30％W / V蔗糖垫，D.离心后的上加载，原子核的颗粒沉积在E，F染色质主要由MNase mononucleomes原位消化，G， H ，我提取可溶性mononucleosomes低渗处理和反复离心剩余的核材料。研究Mononucleosomes从不同的样本（标记桑普在这种情况下，1和2）涂在酶标井系列相同装板和审讯PTM - ABS和PTM -独立的ABS，确定总的染色质加载。K.差分信号的描述在他们的PTM内容不同的两个样品的检测水平，尚未有类似的整体染色质的内容，如反H2B免疫反应来判断。

讨论

NU - ELISA法检测提供了一种方法，以确定在一个特定的细胞类型中的核小体PTMS的全球的地位。 NU - ELISA法研究表明，全球核小体修饰国发散的细胞类型⁴比较不同。此外，NU - ELISA法的PTM配置文件的变化，当细胞暴露后生的调节剂如曲古抑菌素A或小鼠embyronic的干细胞^分化 4时。该方法也被成功地应用于研究人类胚胎干细胞的染色^质 5 。重要的是要注意的NU - ELISA法，以其目前的形式，可以检测只有在细胞表观总和目前PTMS复合签名。这明显不同于全基因组的染色质免疫沉淀，这可确定一个具体的PTM跨特定的基因位点的分布。

NU - ELISA法检测程序的最初步骤，是适应从以前的方法，从哺乳动物^的细胞核6,7隔离mononucleosomes。这些适应的方法提供了一个权宜之计，从哺乳动物细胞中获得高品质的完整的mononucleosomes，以及由此产生的分数是在他们的染色质的内容全面，而且包含大量额外的核材料。由于特定的绝对值，污染，核小体材料的耐受性以及在怒江- ELISA法检测，不像大众规格的办法，需要更大的纯度。然而，NU - ELISA法更敏感，比定量免疫印迹，从而提供了很好的替代品西部片的核小体PTMS的检测和质量规范。

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号	评论
微球菌Nucleae	西格玛	N3755	等分2U/10μl缓冲区，存放在-20 ° C
NUNC MaxiSorp微孔板	费舍尔	12-565-135	胶粘板盖也可以通过费舍尔订购
自动洗板机
1步TMB - ELISA基板	刺穿	34028	保存在4 ° C预温至RT，在使用前或规格表上的指示
酶标仪	BIO - RAD酶标仪（型号：680）		大多数比色法酶标仪模型适合