엘리사에 의해 네이티브 손상 Nucleosomes에 포스트 translational 수정의 감지

요약

Nucleosome 엘리사 (NU - 엘리사)는 기본, 손상 nucleosomes의 준비에서 사후 translational 수정의 글로벌 패턴을 감지하는 민감한과 양적 방법입니다. 이러한 수정 methylations, acetylations 및 특정 히스톤 아미노산 잔류물에 phosphorylations를 포함하고, 따라서 NU - 엘리사는 특정 세포 유형의 전반적인 염색질 수정 상태의 글로벌 proteomic 분석을 제공합니다.

초록

eukaryotes의 게놈은 DNA와 단백질 모두를 포함 염색질로 존재합니다. 염색질의 기본 단위는 두 histones H2A, H2B, H3, H4 ¹ 및 각과 관련된 DNA의 146 기본 쌍을 포함하는 nucleosome입니다. histones의 N - 터미널 꼬리는 리신과 아르기닌이 풍부하고 아세틸화, methylation 및 기타 사후 translational 수정 (PTMS)에 의해 게시 - transcriptionally 수정됩니다. nucleosomes의 PTM 구성함으로써 자연 ^2,3에서 epigenetic는 유전자 규정의 모드를 제공하고, 관련된 DNA의 transcriptional 활동에 영향을 줄 수 있습니다. 우리는 nucleosome 엘리사 (NU - 엘리사)가 양적 세포에서 추출한 nucleosomes의 글로벌 PTM 서명을 확인하기라는 방법을 개발했습니다. NU - 엘리사는 모래 바닥 서양보다 더 민감하고 양적이며, 특정 세포 유형의 epiproteomic 상태를 심문하는 데 유용합니다. 이 비디오 저널 기사는 NU - 엘리사 분석을 수행하는 자세한 절차를 보여줍니다.

프로토콜

1. 포유 동물 세포 배양

NU - 엘리사는 문화의 성장 수있는 모든 포유 동물 세포 종류에 수행할 수 있습니다. 우리는 따라서 여러 가지 항체 (ABS)와 assays를 허용, nucleosomes가 몇 가지 동일하게 로드된 엘리사 접시를 준비하는 충분한 수량에 격리 수 있도록 세포의 대규모 배치에 중간 준비하는 것을 선호합니다. 다음 문화 비늘은 충분한 자료를 제공합니다

마우스 embyronic의 줄기 세포에 대한, 피더 세포없이 세포 중 하나 또는 두 개의 15cm 번호판을 성장. 섬유아 세포의 경우, 합류로 5-10 15cm 번호판을 성장.

2. 핵의 분리

참고 :로 표시를 제외한 모든 단계, 사전 차게 버퍼와 얼음에 있습니다.

1. 접시 당 3 ML의 트립신과 세포를 Trypsinize, 결합, 그리고 얼음처럼 차가운 PBS / butyrate 20 ML를 추가합니다. 5 분 1,000 rpm으로 원심 분리기.
2. 10 ML PBS / butyrate의 세포를 Resuspend 5 분 1,000 rpm으로 원심 분리기.
3. 단백 분해 효소 억제제 (시그마 - 알드리치 P - 8340) 4 개 ML의 용해 버퍼에 Resuspend. 얼음 타입 B의 유봉 20 스트로크를 균질 다운스.
4. 4 10 분 2천g에서 원심 분리기 ° C. (뜨는이 프로토콜에 대한 필요하지 세포질을 포함하지만, 원하는 경우는 다른 용도로 저장할 수 있습니다.)
5. 2 ML 얼음 차가운 씻어 버퍼 C에서 펠렛을 (프로 테아제 억제제와 함께) Resuspend.
6. 레이어 5 ML 30 % 자당 쿠션 통해 resuspended 자료는 다음, 스윙 버킷 로터 5 분 2,400그램에서 원심 분리기. 핵은 쿠션을 통해 마이 그 레이션되며, 파편이 인터페이스에 남아 있습니다.
7. 신중하게 모든 액체 볼륨을 제거하고 250 μl 얼음 차가운 세척 버퍼 C + 프로 테아제 억제제의 핵 resuspend.

3. 현장 Micrococcal Nuclease (MNase) 소화에 의해 Nucleosomes의 분리

우리는 염색질이 뜨는로 무료 그대로 nucleosomes 운전 hypotonic 치료 다음, MNase 그들을 일으키는 핵 이내에 현장에서 소화되는 프로 시저를 사용하십시오.

1. 샘플 3 μl 0.1 M CaCl _2를 추가합니다. 37 ° C 열 블록에 넣어. 37 ° C 온도를 가정하도록 허용합니다.
2. 2 대에게 MNase을 (MNase 버퍼 2 units/10μl에 용해 Micrococcal Nuclease, 시그마 - 알드리치) 추가 후, 37에 대한 품어 ° pipet 팁을 사용하여 자주 혼합 12 분, 대한​​ C.
3. 반응을 중지 0.5 M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 나 -, 산도 8.0 6 μl를 추가합니다. 얼음 입어.
4. 뜨는 폐기, 4 분 2천그램에서 원심 분리기. 300 μl 0.2 MM 나 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)에서 펠렛을 Resuspend. 가끔 부드러운 pipeting 1 H 위해 얼음에 보관하십시오. (이 hypotonic 조건이 핵에서 무료 nucleosomes을 해방).
5. 4 4 분에 대한 3,000그램에서 원심 분리기 ° C. 얼음, 무료 nucleosomes를 포함 뜨는을 저장합니다.
6. 300 μl 0.2 MM 나 - EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산)과 함께 다시 펠렛을 Resuspend. 가끔 부드러운 pipeting 1 H 위해 얼음에 보관하십시오.
7. 4 4min에 대한 3천그램에서 원심 분리기 ° C. 뜨는을 유지하고 5 단계에서 첫 번째 뜨는와 결합. 그 결과 mononucleosome 준비는 -80 ° C.에 aliquoted하고 저장할 수 있습니다

참고 : 염색질의 금액 crudely 10 μl 샘플 260 nm의 흡광도에서 측정하여 quantitated 수있는 것은 물이 990 μl에 추가됩니다. ₂₆₀ = 10 (1백분의 1 희석에 대한 조정 후) 염색질의 약 1mg/ml에 해당합니다. 주로 길이 146 BP의 DNA를 포함해야 MNase digestions의 품질과 범위를 모니터링하기 위해 DNA 내용에 대한 또한, 위의 절차를 수행하는 동안, 작은 샘플이 유지 수 있으며 나중에 분석했다. Laddering 불완전 MNase의 소화 나타내는 것입니다.

참고 : Fig.1은 핵 분리 및 MNase의 digestions 단계의 diagrammed 요약이 포함되어 있습니다.

4. Nucleosome - 엘리사 (NU - 엘리사)

우리는 96 잘 엘리사 microtiter 접시에 고정되었습니다 원시 그대로 nuclesosomes를 포함한 분수에 PTMS를 감지. 각 샘플의 경우, 우리는 2 배 dilutions 일련의를하고, 이러한 세중의에 우물에 코팅됩니다.

1. 4 명이 50 μl / 음의 코팅 버퍼에 희석 nucleosomes와 C.에서 하룻밤 코트 MaxiSorp 플레이트 nucleosomes의 제안 시리얼 이중의 dilutions는 바닥에서만 코팅 버퍼 (0 μg의 염색질)와 0.1 μg, 0.05 μg, 0.025 μg, 0.0125 μg, 0.00625 μg, 0.00313 μg, 0.00156 μg을 추가하여 아래 행 맨 앞줄에서 준비가되어 행. (참고 : 판 표지이 단계가 필요합니다.)
2. 아침에 접시 세척기 10 분 결합된 총 실온 (RT) 200 μl / 잘 PBS/0.5 % 트윈 - 20와 함께 접시 4 번 씻으십시오.
3. 100 μl / 잘 PBS/0.05 % 트윈 - 5분의 20 %의 BSA와 RT에서 블록 1 시간.
4. 여전히 쌩쌩하게 거꾸로 판을 흔들어하여 차단 버퍼를 제거싱크대에. 커버 및 -20 ° C에서 접시를 저장하거나, 다음 단계로 바로 진행합니다.
5. PBS/0.05 % 회전에서 1 시간 동안 RT에서 품어 트윈 - 20 / 5% BSA, 50 잘 희석 / μl 1:1000의 볼륨 (또는 필요에 따라)에 1 ° 애비를 추가합니다.
6. RT 200 μl / 잘 PBS/0.5 % 트윈 - 20과 접시 세척기 10 분 결합된 총 접시 4 번 씻으십시오.
7. 기다려봐 퍼옥시데이즈 (HRP) 복합 2 · 애비, PBS/0.05 % 회전에 시간 RT에서 트윈 - 20 / 5% BSA에서 (또는 필요한) 1:5000 희석을 추가합니다.
8. 200 μl / 잘 PBS/0.5 % 트윈 - 20와 함께 접시 4 번 씻으십시오. 각 세차 플레이트 와셔와 RT에서 10 분 총입니다.
9. RT 10 분 각 잘하는 TMB 기판의 50 μl를 추가하여 번호판을 개발할 수 있습니다. 50 μl / 잘 SO ₄ H ₂ 2N의를 추가하여 반응을 중지하고 접시 450 nm의를 참조하십시오. (팁 : 이전 읽는 absorbances에 우물에 기포를 분산하기 위해 플레이트 로터를 사용하여 2 분 1,500 rpm으로 원심 분리기).
10. 양적 및 통계 분석을위한 스프레드 시트 파일에 수치를 내보냅니다.

시약

PBS / butyrate

135 MM NaCl

2.5 MM KCl

8 MM 나 2 HPO 4

1.5 MM KH 2 PO 4

10 MM 나 - butyrate

용해 완충액

250 MM의 자당

10 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4

10 MM 나 - butyrate

4 MM MgCl 2

0.1 % 트리톤 X - 100

와시 버퍼 C

250 MM의 자당

10 MM 트리스 - HCL, pH를 7.4

10 MM 나 - butyrate

4 MM MgCl 2

자당 쿠션

30 % (W / V) 씻어 버퍼 C에서 자당

Microccocal Nuclease 버퍼

5 MM 나포 4 버퍼, pH를 7.0

0.025 MM CaCl 2

코팅 버퍼

80ml 솔루션 170ml + 솔루션 B + 250ml DH 2 O

솔루션 : 0.2 M 나 2 CO 3

솔루션 B : 0.2 M NaHCO 3

5. 대표 결과

NU - 엘리사 방법, 염색질은 mononucleosomes의 형태로 준비로 로드할 수있는 준비가되어 몇 가지 동일한 접시 일련의 사용. 우리는 일반적으로 각각 다른 안티 - PTM 특정 항체 (ABS)로 탐색할 수 있도록 동일하게 - 로드된 접시의 시리즈를 준비합니다. 우리는 또한 항상 수정 상태 전체 염색질 로딩 컨트롤에 관계없이 histones을 감지 AB와 함께 탐색할 수있는 접시를 준비합니다. 이 컨트롤은 나중에 양적 다른 샘플에서 준비 nucleosomes의 PTM 내용을 비교하기 위해서는 필수적입니다. 우리가이 접근법을 사용하여 원시 흡광도 값을 수정 주어진 염색질 샘플 내에서 PTMS의 수준을 quantitate하려면 다음과 같이 첫째, 우리는 염색질을 (배경 일반적으로 무시할 수)가 포함된없는 컨트롤 우물에서 얻은 값을 사용하는 백그라운드 신호를 뺍니다. 우리는 그들의 수정 상태의 독립 nucleosomes을 감지 AB와 함께 assayed되었습니다 동일하게 읽어 접시에서 얻은 NU - 엘리사 결과에 PTM 특정 신호를 표준화. (우리는이 목적을 위해 histones H2A H2B 또는 특정 polyclonal 애비를 사용했습니다.) 그러면 염색질 각각의 희석에 대한 의미와 차이를 결정하고, 엘리사 분석의 선형 부분에서 얻은 데이터를 사용합니다. NU - 엘리사 수학 및 통계 분석의 상세한 예제는 이전에 다음 ID로 ^{사보고되었습니다}

그림 1. NU - 엘리사 단계의 개략도 diagam. A. 포유 동물 세포 수확되며 B.의 핵은 다운스 H로 세포의 분리omogenization, C.는 세포 원심 분리 후 30 % W / V 자당 쿠션, D. 위에 로드된 중단, 핵은 펠릿로 입금되며 E, F. 염색질은 MNase에 의해 주로 mononucleomes로 현장에서 소화되며 G, H 전. 가용성식이 mononucleosomes는 hypotonic 치료 및 잔류 핵 물질의 반복 원심 분리에 의해 압축이 풀립니다. J.의 Mononucleosomes는 여러 샘플에서 (표시 샘프.이 경우에는 1, 2)는 동일하게 - 로드된 접시의 일련의 microtiter 우물에 코팅과 함께 심문 아르 총 염색질 로딩을 결정 PTM 특정 애비 및 PTM 독립 애비. 자신의 PTM 내용에 차이가 샘플 두개의 차동 신호 검출 수준의 K.의 묘사는 아직 같은 안티 H2B immunoreactivity로 판단, 유사한 전체 염색질의 콘텐츠를합니다.

토론

NU - 엘리사는 특정 세포 유형 내에서 현재 nucleosome PTMS의 글로벌 상태를 확인할 수있는 방법을 제공합니다. NU - 엘리사 연구는 글로벌 nucleosome 수정 상태가 분기하는 세포 유형 ⁴ 비교에서 다르다 것으로 나타났습니다. 세포가 같은 epigenetic modulatory 에이전트에 노출되면 또한, NU - 엘리사 PTM 프로필은 변경 trichostatin - A 때 또는 마우스 embyronic의 줄기 세포가 ⁴ 차별하고 있습니다. 방법은 또한 인간의 ES 세포 ⁵ 염색질 연구를 성공적으로 적용되었습니다. NU - 엘리사가 현재의 형태로, 세포 epigenome의 합계 내에서 현재 PTMS만을 합성 서명을 검색할 수 있습니다하는 것이 중요합니다. 이것은 특정 유전 loci에 걸쳐 특정 PTM의 분포를 확인할 수 있습니다 게놈 전체 염색질의 immunoprecipitation에서 현저하게 다릅니다.

NU - 엘리사 절차의 ​​초기 단계는 포유류의 핵 ^6,7에서 mononucleosomes을 분리하기 위해 이전 방법에서 조정됩니다. 이러한 적응 방법은 포유 동물 세포에서 고품질 그대로 mononucleosomes을 얻기 위해 편법 방법을 제공하고, 그 결과 분수들은 염색질 콘텐츠에 포괄하지만, 추가 핵 물질의 큰 거래를 포함하고 있습니다. 특정 애비가 사용되므로, 비 nucleosomal 자료를 오염하는 것은 큰 순결을 요구 대량 사양 접근법과는 달리, NU - 엘리사 분석에 잘 용납입니다. 그러나, NU - 엘리사는 서쪽이 서부와 nucleosomal PTMS의 검출을위한 질량 분석기 좋은 대안을 제공함으로써, ⁴ 모래 바닥보다 더 민감하고 양적입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Micrococcal Nucleae	시그마	N3755	-20 ° C에 저장이 U/10μl 버퍼의 aliquots를 확인
Nunc MaxiSorp Microtiter 플레이트	어부	12-565-135	접착제 플레이트 커버도 피셔를 통해 주문할 수
자동 플레이트 와셔
1 단계 TMB - 엘리사 기판	찌르다	34,028	4 스토어 ° C 사용하기 전에 RT 미리 따뜻하게 또는 사양서에 대한 감독
Microtiter 플레이트 리더	바이오 래드 microplate 리더 (모델 : 680)		대부분의 colorimetric 플레이트 판독기 모델 적합