Обнаружение посттрансляционной Изменения по земельному Неповрежденный нуклеосом с помощью ИФА

Резюме

Нуклеосом ELISA (НУ-ИФА) является чувствительным и количественный метод для выявления глобальных моделей пост-поступательные изменения в препаратах родной, нетронутыми нуклеосом. Эти изменения включают methylations, acetylations и phosphorylations в определенных гистонов аминокислотных остатков, и, следовательно, НУ-ELISA обеспечивает глобальную протеомных анализа общего состояния модификации хроматина специфические типы клеток.

Аннотация

Геном эукариот существует в виде хроматина, которая содержит как ДНК и белки. Основной единицей хроматина нуклеосомы, который содержит 146 пар оснований ДНК, связанных с двумя каждая из гистонов H2A, H2B, H3, H4 и ^1. N-терминал хвосты гистоны, богатые лизином и аргинином и изменяются после транскрипционно ацетилированием, метилирование, и других пост-трансляционной модификации (PTMs). PTM конфигурации нуклеосом могут повлиять транскрипционной активности связано ДНК, обеспечивая тем самым режим регуляции генов, которые в природе эпигенетических ^2,3. Мы разработали метод, называемый нуклеосом ELISA (НУ-ELISA) количественно определить глобальные подписей PTM нуклеосом извлечены из клеток. НУ-ELISA является более чувствительной и количественные, чем западные промокательную, и полезно, чтобы допросить epiproteomic состояние специфические типы клеток. В данной статье видео журнал показывает подробные процедуры для выполнения НУ-ELISA анализа.

протокол

1. Культуры клеток млекопитающих

НУ-ИФА может быть выполнена на любом типе клеток млекопитающих, которые можно выращивать в культуре. Мы предпочитаем готовить умеренной до больших партий клеток так, чтобы нуклеосом могут быть выделены в достаточном количестве, чтобы подготовить несколько одинаково загружены ИФА пластин, что позволяет тестов с несколькими различными антителами (ABS). Следующие весы культуры предоставляют широкие материал:

Для клеток мыши embyronic стебель, растут один или два 15 см пластинах клеток без фидерных клеток. Для фибробластов, рост от 5 до 10 15 пластин см до слияния.

2. Выделение ядер

Примечание: Все шаги на льду с предварительно охлажденных буферов, если не указано иное.

1. Trypsinize клеток с 3 мл трипсина на чашку, объединить и добавить 20 мл ледяной PBS / бутират. Центрифуга при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин.
2. Ресуспендируют клеток в 10 мл PBS / бутирата и центрифуге при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин.
3. Ресуспендируют в 4 мл лизирующего буфера с ингибиторами протеазы (Sigma-Aldrich P-8340). Dounce гомогенизации 20 ударов типа B пестиком на льду.
4. Центрифуга на 2000 г в течение 10 мин при 4 ° C. (Супернатант содержит цитоплазму, которая не нужна для этого протокола, но он может быть сохранен для других целей при желании).
5. Ресуспендируют гранул в 2 мл ледяной промывочный буфер С (с ингибиторами протеазы).
6. Слой ресуспендировали материала по 5 мл 30% сахарозы подушке, то центрифуге при 2400g в течение 5 мин в Бакет ротор. Ядрами будут мигрировать через подушку, и мусор остается на интерфейс.
7. Удалите все тщательно объема жидкости и ресуспендируйте ядер в 250 мкл ледяной промывочного буфера C + ингибиторы протеазы.

3. Изоляция от нуклеосом на месте микрококковой нуклеазой (MNase) Пищеварение

Мы используем процедуру, в которой хроматина переваривается на месте внутри ядра, придавая им MNase, после лечения гипотонических управлять свободными нетронутыми нуклеосом в супернатант.

1. Добавить 3 мкл 0,1 М CaCl ₂ к образцу. Положить в 37 ° C тепла блока. Позвольте предположить 37 ° С температура.
2. Добавить 2 единицы MNase (микрококковой нуклеазой, Sigma-Aldrich, растворенный в 2 units/10μl в буфере MNase), то инкубировать при 37 ° С в течение 12 мин, с частым использованием смешивания пипеткой чаевые.
3. Добавить 6 мкл 0,5 М Na-ЭДТА, рН 8,0, чтобы остановить реакцию. Положите на льду.
4. Центрифуга на 2000 г в течение 4 минут, удалите супернатант. Ресуспендируют осадок в 300 мкл 0,2 мМ Na-ЭДТА. Магазин на льду в течение 1 ч с редкими нежными pipeting. (Эти гипотонических условиях освободить свободное нуклеосом из ядер).
5. Центрифуга на 3000 г в течение 4 мин при 4 ° C. Сохранить супернатант, который содержит свободные нуклеосом, на льду.
6. Ресуспендируют гранулы снова с 300 мкл 0,2 мМ Na-ЭДТА. Магазин на льду в течение 1 ч с редкими нежными pipeting.
7. Центрифуга в 3000г на 4 мин при 4 ° C. Сохраните супернатант и в сочетании с первым супернатант с шага 5. В результате mononucleosome препараты могут быть аликвоты и хранили при -80 ° C.

Примечание: количество хроматина можно грубо количественно, измеряя поглощение при 260 нм в 10 мкл образца добавляется 990 мкл воды. ₂₆₀ = 10 (с поправкой на 1 / 100 разбавление) соответствует примерно 1mg/ml хроматина. Также, в ходе описанной выше процедуры, маленькие образцы могут быть сохранены, а затем проанализировать их содержание ДНК для контроля качества и степени MNase пищеварения, которые должны преимущественно содержат ДНК из 146 б.п. в длину. Laddering указывает на неполное переваривание MNase.

Примечание: Рис.1 содержит диаграммах резюме ядерной изоляции и MNase пищеварения шагов.

4. Нуклеосом-ELISA (НУ-ИФА)

Мы обнаружить PTMs на фракции, содержащие родной нетронутыми nuclesosomes, которые были иммобилизованных на 96 лунок ИФА пластин микротитрования. Для каждого образца, мы делаем серию 2-кратные разведения, и они наносят на скважинах в трех экземплярах.

1. Пальто MaxiSorp пластин течение ночи при 4 ° С при 50 мкл / лунку нуклеосом разводится в буферном покрытии. Предлагаемые серийных разведений вдвое нуклеосом готовятся из верхней строки до нижней строки, добавляя 0,1 мкг, 0,05 мкг, 0,025 мг, 0,0125 мкг, 0,00625 мкг, 0,00313 мкг, 0,00156 мкг, с покрытием буфер только (0 мкг хроматина) в нижнем подряд. (Примечание: пластина покрывает необходимые для этого шага.)
2. По утрам, мыть пластин в 4 раза с 200 мкл / лунку PBS/0.5% Твин-20 при комнатной температуре (RT) для в общей сложности 10 минут с пластиной шайбы.
3. Блок 1 час при комнатной температуре со 100 мкл / лунку PBS/0.05% Твин-20 / 5% BSA.
4. Удалите блокирующий буфер, встряхивая перевернутая пластина быстронад раковиной. Накрыть крышкой и хранить пластины при температуре -20 ° С, или сразу перейти к следующему шагу.
5. Добавить 1 ° Abs в объеме 50 мкл / лунку разбавленного 1:1000 (или по мере необходимости) в PBS/0.05% Твин-20 / 5% BSA, инкубировать при комнатной температуре в течение 1 часа на ротатора.
6. Промыть пластины в 4 раза с 200 мкл / лунку PBS/0.5% Твин-20 при комнатной температуре и в общей сложности 10 мин в устройство для промывания планшетов.
7. Добавить пероксидазой хрена (HRP)-сопряженные 2 ° абс, разбавленный 1:5000 (или по мере необходимости) в PBS/0.05% Твин-20 / 5% БСА при комнатной температуре в течение часа на ротатора.
8. Промыть пластины в 4 раза с 200 мкл / лунку PBS/0.5% Твин-20. Каждая промывка при комнатной температуре и в общей сложности 10 минут с пластиной шайбы.
9. Разработка пластин добавлением 50 мкл ТМВ субстрата в каждую лунку в течение 10 мин при комнатной температуре. Остановить реакцию добавлением 50 мкл / лунку 2N H ₂ SO ₄ и читать пластин 450 нм. (Совет: центрифуги при 1500 оборотов в минуту в течение 2 мин с использованием пластин ротора, чтобы снять пузырьков воздуха в скважины до чтения абсорбции).
10. Экспорт чтениях в файлы электронных таблиц, для количественного и статистического анализа.

Реагенты

PBS / бутират

135 мМ NaCl

2,5 мМ KCl

8 мМ Na 2 HPO 4

1,5 мМ KH 2 PO 4

10 мМ Na-бутират

Лизис буфера

250 мМ сахарозы

10 мМ Трис-HCl, рН 7,4

10 мМ Na-бутират

4 мМ MgCl 2

0,1% Triton X-100

Промывочного буфера C

250 мМ сахарозы

10 мМ Трис-HCl, рН 7,4

10 мМ Na-бутират

4 мМ MgCl 2

Сахароза Подушка

30% (вес / объем) сахарозы в промывочный буфер C

Microccocal нуклеазы буфера

5 мМ NaPO 4 буфера, рН 7,0

0,025 мМ CaCl 2

Покрытие буфер

80 мл раствора А + 170ml Решение B + 250 мл дН 2 O

Решение: 0.2 М Na 2 CO 3

Раствор В: 0,2 М NaHCO 3

5. Представитель Результаты

Использование НУ-ИФА метод, серия из нескольких одинаковых пластин готовы который может быть загружен с хроматином подготовлен в форме mononucleosomes. Как правило, мы подготовить серию одинаково нагруженных пластин, так что каждый может быть исследовали с различными анти-PTM специфических антител (ABS). Мы также всегда готовятся пластины, которые могут быть проверены с Ab, которая обнаруживает гистонов, независимо от их модификации состоянии полностью контролировать загрузку хроматина. Этот контроль является важным для того, чтобы позже количественно сравнить PTM содержание нуклеосом приготовленные из разных образцов. Для количественной оценки уровня PTMs в пределах данного образца хроматина мы исправляем сырые значения абсорбции с использованием этого подхода: во-первых, мы вычитаем любом фоне сигнал, используя значения, полученные из-под контроля скважин, не содержащих хроматина (фон, как правило, незначительно). Затем мы стандартизировать ПТМ-специфические сигналы, чтобы НУ-ИФА результаты, полученные одинаково загружены пластина, которая была проверена с Ab, которая обнаруживает нуклеосом, независимо от их модификации государства. (Мы использовали поликлональные Abs, специфичные для гистонов H2A или H2B для этой цели). Мы затем определить, средних и дисперсий для каждого разведения хроматина, а также использовать данные, полученные из линейной части анализа ELISA. Подробные примеры НУ-ИФА математических и статистических анализов были зарегистрированы ранее ⁴

Рисунок 1. Схема diagam НУ-ИФА шагов. А. клетках млекопитающих собирают, Б. ядра отделяют от клеток Dounce чomogenization, К. разрушенных клеток загружаются на вершине 30% вес / объем сахарозы подушке, Д. После центрифугирования ядра осаждаются в гранулах, E, F. хроматина перевариваются на месте в основном mononucleomes по MNase, G, H , я. Растворимые mononucleosomes извлекаются по гипотоническому лечения и повторного центрифугирования остаточного ядерного материала. Дж. Mononucleosomes из разных образцов (помечены SAMP. 1 и 2 в данном случае) покрыты на лунки в серии одинаково нагруженных пластин и допрашивали с PTM конкретных Abs и ПТМ-независимых Abs, чтобы определить общую загрузку хроматина. К. изображение дифференциального сигнала уровень детектирования при двух образцов, отличающихся по своему PTM содержание, но и те же общие содержания хроматина, если судить по анти-H2B иммунореактивности.

Обсуждение

НУ-ELISA обеспечивает способ установить глобальный статус нуклеосом PTMs присутствует в определенного типа клеток. НУ-ИФА исследования показали, что глобальное нуклеосом государств модификации отличаются в сравнениях расходящихся типов клеток ^4. Кроме того, НУ-ИФА PTM профили изменения, когда клетки подвергаются эпигенетические агентов, таких как модулирующее trichostatin-или когда клетки мыши embyronic стволовых дифференцированных ^4. Метод также успешно применяется для изучения хроматина клеток человека Е. С. ^5. Важно отметить, НУ-ИФА, в его нынешней форме, можно обнаружить только композитный подпись PTMs присутствует в сумме сотовой эпигенома. Это заметно отличается от генома хроматин иммунопреципитации, которые могут определить распределение конкретных PTM через специфических генетических локусов.

Начальные шаги НУ-ИФА процедуры взяты из предыдущих методов, чтобы изолировать от mononucleosomes млекопитающих ядер ^6,7. Эти адаптированные методы обеспечивают целесообразным способом получения высококачественных нетронутыми mononucleosomes из клеток млекопитающих, и в результате фракций являются всеобъемлющими в своих хроматина содержания, но содержат большое количество дополнительной ядерного материала. Поскольку специфические Abs используются, загрязняя не-нуклеосомной материал хорошо переносится в НУ-ИФА анализа, в отличие от массового спецификации подходы, которые требуют большей чистоты. Тем не менее, НУ-ELISA является более чувствительной и количественные, чем западные промокательной ^4, тем самым обеспечивая хорошую альтернативу вестерны и массовых спецификации для обнаружения нуклеосомной PTMs.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Название реагента	Компания	Номер в каталоге	Комментарии
Микрококковой Nucleae	Сигма	N3755	Сделать аликвоты 2 U/10μl буфер, хранится при температуре -20 ° C
Nunc MaxiSorp Микротитровальные пластины	Рыболов	12-565-135	Клей покрывает пластины можно также заказать через Фишер
Автоматизированная Стиральная машина пластины
Шаг 1-TMB-ИФА субстрата	Проколоть	34028	Хранить при температуре 4 ° С предварительно теплой до комнатной температуры перед использованием или, как указано на спецификации
Микропланшетный ридер	Bio-Rad микропланшетов читателя (модели: 680)		Большинство моделей читателю колориметрического пластины подходят