Erkennung von Post-translationale Modifikationen auf Native Intact Nukleosomen mittels ELISA

Zusammenfassung

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) ist eine sensible und quantitative Methode zur globalen Muster der post-translationale Modifikationen in Zubereitungen native, intakte Nukleosomen zu erkennen. Diese Änderungen umfassen Methylierungen, Acetylierungen und Phosphorylierungen an bestimmten Histon Aminosäurereste und damit NU-ELISA bietet eine globale Proteom-Test des Gesamtsystems Chromatin Modifikation Staaten von spezifischen Zelltypen.

Zusammenfassung

Das Genom der Eukaryoten existiert als Chromatin, die sowohl DNA und Proteine ​​enthält. Die Grundeinheit des Chromatins ist das Nukleosomen, die 146 Basenpaaren der DNA mit je zwei der Histone H2A, H2B, H3 und H4 ¹ zugeordnet enthält. Die N-terminalen Enden der Histone sind reich an Lysin und Arginin und post-transkriptionell durch Acetylierung, Methylierung und andere post-translationale Modifikationen (PTM) modifiziert. Die PTM-Konfiguration der Nukleosomen kann sich auf die transkriptionelle Aktivität von assoziierten DNA, wodurch eine Art der Genregulation, dass epigenetische in der Natur ist ^2,3. Wir entwickelten eine Methode namens Nukleosomen ELISA (NU-ELISA) zur quantitativen Bestimmung globaler PTM Unterschriften von Nukleosomen aus Zellen extrahiert. NU-ELISA ist empfindlicher und quantitative als Western-Blot, und ist nützlich, um die epiproteomic Zustand der spezifischen Zelltypen zu verhören. Dieses Video Zeitschriftenartikel zeigt detaillierte Verfahren zur NU-ELISA-Analyse durchzuführen.

Protokoll

1. Mammalian Cell Culture

NU-ELISA kann auf jedem Säugetier-Zelle Typ, der in Kultur gezüchtet werden können durchgeführt werden. Wir bevorzugen die Vorbereitung mäßige bis große Chargen von Zellen, so dass Nukleosomen in ausreichender Menge isoliert werden kann, um mehrere identisch geladen ELISA-Platten vorzubereiten, so dass Tests mit verschiedenen Antikörpern (ABS). Die folgenden Kultur Skalen bieten reichlich Material:

Für Maus embyronic Stammzellen wachsen ein oder zwei 15 cm-Platten von Zellen ohne Feeder-Zellen. Für Fibroblasten wachsen 5 bis 10 15 cm-Platten bis zur Konfluenz.

2. Isolierung der Zellkerne

Hinweis: Alle Schritte werden auf Eis mit vorgekühlten Puffer, außer wie angegeben.

1. Trypsinize Zellen mit 3 ml Trypsin pro Platte, kombinieren und mit 20 ml eiskaltem PBS / Butyrat. Zentrifugation bei 1000 rpm für 5 min.
2. Resuspendieren der Zellen in 10 ml PBS / Butyrat und Zentrifuge bei 1000 rpm für 5 min.
3. Resuspendieren in 4 ml Lysepuffer mit Protease-Inhibitoren (Sigma-Aldrich P-8340). Dounce homogenisieren 20 Hübe mit Typ-B Pistill auf Eis.
4. Zentrifugation bei 2000g für 10 min bei 4 ° C. (Der Überstand enthält Zytoplasma, die nicht für dieses Protokoll benötigt wird, aber es kann für andere Zwecke gespeichert werden, wenn gewünscht).
5. Das Pellet in 2 ml eiskaltem Waschpuffer C (mit Protease-Inhibitoren).
6. Schicht der resuspendierten Material über 5 ml 30% Saccharose-Kissen, dann auf 2400g zentrifugieren Sie für 5 min in einem Ausschwingrotor. Kerne werden durch Kissen zu migrieren, und Schutt bleibt an der Oberfläche.
7. Entfernen Sie alle Flüssigkeitsvolumen sorgfältig und resuspendieren die Kerne in 250 ul eiskaltem Waschpuffer C + Protease-Inhibitoren.

3. Isolierung von Nukleosomen durch in situ Mikrokokken-Nuclease (MNase) Verdauung

Wir verwenden ein Verfahren, bei dem Chromatin in situ innerhalb Kerne ist durch Infusion von ihnen mit MNase, gefolgt von einer hypotonen Behandlung kostenlos erhalten Nukleosomen in den Überstand Laufwerk verdaut.

1. Add 3 ul 0,1 M CaCl ₂ auf die Probe. Legen Sie in 37 ° C Wärme zu blockieren. Lassen Sie die 37 ° C Temperatur annehmen.
2. Add 2 Einheiten MNase (Mikrokokken-Nuclease, Sigma-Aldrich, bei 2 units/10μl in MNase Puffer gelöst), dann bei 37 ° C für 12 min, mit häufigem Mischen mit einer Pipettenspitze.
3. Add 6 ul von 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0, um die Reaktion zu stoppen. Auf Eis gelegt.
4. Zentrifugation bei 2000g für 4 min, Überstand verwerfen. Das Pellet in 300 ul 0,2 mM Na-EDTA. Auf Eis für 1 h mit gelegentlichen sanften Pipettieren. (Diese hypotonen Bedingungen befreien freien Nukleosomen aus Kernen).
5. Zentrifugation bei 3000 g für 4 min bei 4 ° C. Speichern der Überstand, der freien Nukleosomen enthält, auf dem Eis.
6. Das Pellet erneut mit 300 ul 0,2 mM Na-EDTA. Auf Eis für 1 h mit gelegentlichen sanften Pipettieren.
7. Zentrifugation bei 3000g für 4min bei 4 ° C. Behalten Sie den Überstand und verbinden sich mit dem ersten Überstand aus Schritt 5. Die daraus resultierende mononucleosome Präparate können aliquotiert und bei -80 ° C gelagert werden

Hinweis: Die Höhe des Chromatins grob durch Messung der Absorption bei 260 nm einer 10 ul Probe quantifiziert werden hinzugefügt bis 990 l Wasser. A ₂₆₀ = 10 (bereinigt um die 1 / 100 Verdünnung) entspricht etwa 1mg/ml von Chromatin. Auch während der oben genannten Verfahren können kleine Proben aufbewahrt und später analysiert für ihre DNA-Gehalt, um die Qualität und den Umfang der MNase Aufschlüsse, die überwiegend enthalten, sollten DNA von 146 bp in der Länge zu überwachen. Laddering ist bezeichnend für unvollständige MNase Verdauung.

Hinweis: Abb.1 enthält eine Zusammenfassung der diagrammed nuklearen Isolation und MNase Aufschlüsse Schritte.

4. Nucleosome-ELISA (NU-ELISA)

Wir erkennen PTMs auf Fraktionen, die nativen intakten nuclesosomes, die auf 96-Well-ELISA Mikrotiterplatten immobilisiert wurden. Für jede Probe, wir machen eine Reihe von 2-fach Verdünnungen, und diese sind auf Brunnen in dreifacher Ausfertigung beschichtet.

1. Coat MaxiSorp Platten über Nacht bei 4 ° C mit 50 ul / well der Nukleosomen in Beschichtungs-Puffer verdünnt. Empfohlene serielle zweifache Verdünnungen der Nukleosomen sind aus oberen Reihe auf der unteren Reihe durch Zugabe von 0,1 pg, 0,05 pg, 0,025 ug, 0.0125 ug 0,00625 ug 0,00313 ug 0,00156 pg vorbereitet, mit Beschichtungs-Puffer nur (0 pg Chromatin) im unteren Reihe. (Hinweis: Platte Abdeckungen sind für diesen Schritt erforderlich.)
2. Am Morgen waschen Sie die Platten 4 mal mit 200 ul / well PBS/0.5% Tween-20 bei Raumtemperatur (RT) für eine Summe von 10 min mit einer Platte Scheibe.
3. Block 1 h bei RT mit 100 ul / well PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA.
4. Entfernen Sie die Blocking-Puffer durch Schütteln des invertierten Platte zügigüber ein Waschbecken. Cover und speichern Sie die Platten bei -20 ° C, oder gehen Sie direkt zum nächsten Schritt.
5. Add 1 ° Abs in einem Volumen von 50 ul / well verdünnt 1:1000 (oder je nach Bedarf) in PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA bei RT für 1 Stunde auf einem Rotator inkubiert.
6. Wash Platten 4 mal mit 200 ul / well PBS/0.5% Tween-20 bei RT und für eine Summe von 10 min in einem Plattenwäscher.
7. Add Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem 2 ° Abs, verdünnt 1:5000 (oder je nach Bedarf) in PBS/0.05% Tween-20 / 5% BSA bei RT für eine Stunde auf einem Rotator.
8. Wash Platten 4 mal mit 200 ul / well PBS/0.5% Tween-20. Jeder waschen bei RT und für insgesamt 10 Minuten mit einem Plattenwäscher.
9. Entwickeln Sie die Platten durch Zugabe von 50 ul TMB Substrat in jede Vertiefung für 10 min bei RT. Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 50 ul / Vertiefung 2N H ₂ SO ₄ und lesen Sie die Platten 450 nm. (Tipp: Zentrifugation bei 1500 rpm für 2 min mit einem Platten-Rotor, um die Luftblasen in den Vertiefungen vor dem Lesen Extinktionen abführen).
10. Export der Messwerte in Excel Dateien für quantitative und statistische Analysen.

Reagenzien

PBS / Butyrat

135 mM NaCl

2,5 mM KCl

8 mM Na 2 HPO 4

1,5 mM KH 2 PO 4

10 mM Na-Butyrat

Lysispuffer

250 mM Saccharose

10 mM Tris-HCl, pH 7,4

10 mM Na-Butyrat

4 mM MgCl 2

0,1% Triton X-100

Waschpuffer C

250 mM Saccharose

10 mM Tris-HCl, pH 7,4

10 mM Na-Butyrat

4 mM MgCl 2

Saccharose-Kissen

30% (w / v) Saccharose in Waschpuffer C

Microccocal Nuclease Puffer

5 mM NaPO 4, pH 7,0

0,025 mm CaCl 2

Coating-Puffer

80ml Lösung A + 170ml Lösung B + 250ml dH 2 O

Lösung A: 0,2 M Na 2 CO 3

Lösung B: 0,2 M NaHCO 3

5. Repräsentative Ergebnisse

Mit dem NU-ELISA-Methode, eine Reihe von mehreren identischen Platten hergestellt werden, die beladen mit Chromatin in Form von mononucleosomes vorbereitet werden können. Wir bereiten in der Regel Folge von identisch beladenen Platten, so dass jeder mit unterschiedlichen anti-PTM-spezifischen Antikörpern (Abs) untersucht werden können. Wir haben auch stets einen Teller, der mit einem Ab, dass Histone erkennt ohne Rücksicht auf deren Modifikation Staat insgesamt Chromatin Ladekontrolle untersucht werden können. Diese Kontrolle ist notwendig, um später quantitativ zu vergleichen PTM Inhalt der Nukleosomen aus verschiedenen Proben hergestellt von wesentlicher Bedeutung. Um quantifizieren das Niveau der PTMs innerhalb einer bestimmten Chromatin Probe korrigieren wir die Rohstoffe Extinktionswerte mit diesem Ansatz: Zuerst subtrahieren wir alle Hintergrund-Signal mit Werten aus Kontrollvertiefungen enthält keine Chromatin (Hintergrund ist in der Regel vernachlässigbar) erhalten. Wir haben dann zu standardisieren PTM-spezifische Signale zu NU-ELISA Ergebnisse aus einem identisch geladen Platte, die mit einem Ab, dass Nukleosomen unabhängig von deren Modifikation Staat erkennt untersucht wurde erhalten. (Wir haben polyklonalen Abs spezifisch für Histone H2A H2B oder für diesen Zweck verwendet). Wir bestimmen dann Mittelwerte und Varianzen für jede Verdünnung von Chromatin, und verwenden Sie Daten aus dem linearen Teil der ELISA-Test erhalten. Ausführliche Beispiele von NU-ELISA mathematischen und statistischen Analysen wurden bisher ⁴ gemeldet

Abbildung 1. Schematische diagam der NU-ELISA Schritte. A. Mammalian Cells geerntet werden; B. Kerne sind aus Zellen, die durch Dounce h getrenntomogenization, C. aufgeschlossenen Zellen auf der Spitze eines 30% w / v Saccharose-Kissen, D. Nach dem Zentrifugieren geladen werden, werden Kerne in das Pellet abgeschieden; E, F. Chromatin sind in situ überwiegend mononucleomes durch MNase verdaut; G, H , Ich. Löslich mononucleosomes durch hypotone Behandlung und wiederholte Zentrifugation des restlichen Kernmaterial extrahiert. J. Mononucleosomes aus verschiedenen Proben (mit samp. 1 und 2 in diesem Fall) auf Mikrotitervertiefungen in Serie identisch beladenen Platten beschichtet und verhört mit PTM-Risikoabdeckung spezieller ABS-und PTM-unabhängige Abs insgesamt Chromatin Laden zu bestimmen. K. Darstellung der Differenz-Signal-Erkennung Ebenen in zwei Proben, die in ihrer PTM Inhalt unterscheiden, aber ähnliche insgesamt Chromatingehalt, wie anti-H2B-Immunreaktivität beurteilt.

Diskussion

NU-ELISA bietet eine Methode, um den globalen Status der Nukleosomen PTMs Gegenwart in einem bestimmten Zelltyp zu ermitteln. NU-ELISA-Studien haben gezeigt, dass die globale nucleosome Änderung Staaten Vergleiche unterschiedlicher Zelltypen ⁴ unterscheiden. Darüber hinaus ändern NU-ELISA PTM-Profilen, wenn Zellen epigenetische modulatorische Substanzen wie ausgesetzt sind Trichostatin-A oder, wenn die Maus embyronic Stammzellen sind ⁴ differenziert. Die Methode wurde auch erfolgreich auf das Chromatin der menschlichen ES-Zellen ^5-Studie angewandt. Es ist wichtig zu beachten, die NU-ELISA, in seiner jetzigen Form kann nur der Composite-Signatur PTMs innerhalb des Summe der zellulären Epigenom zu erkennen. Dies unterscheidet sich deutlich von genomweiten Chromatinimmunpräzipitation, der die Verteilung eines bestimmten PTM über spezifische genetische Loci bestimmen kann.

Die ersten Schritte des NU-ELISA-Verfahren werden aus den bisherigen Methoden angepasst mononucleosomes aus Säugetier-Kerne ^6,7 isolieren. Diese angepasste Methoden bieten eine sinnvolle Möglichkeit, qualitativ hochwertige intakt mononucleosomes aus Säugetier-Zellen zu erhalten, und die erhaltenen Fraktionen sind umfassend in ihrem Chromatin Inhalt, sondern enthalten eine Vielzahl von zusätzlichen Kernmaterial. Da die spezifischen Abs verwendet werden, ist verunreinigt nicht nukleosomalen Material gut in die NU-ELISA-Test vertragen, im Gegensatz zu Massen-spec Ansätze, die eine größere Reinheit erfordern. Allerdings ist NU-ELISA empfindlicher und quantitative als ^{Western-Blot-4,} so dass eine gute Alternative zu Western und Massenspektrometrie zum Nachweis von nukleosomalen PTMs.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name des Reagenzes	Firma	Katalog-Nummer	Kommentare
Mikrokokken Nucleae	Sigma	N3755	Machen Aliquots von 2 U/10μl Puffer bei -20 ° C gelagert
Nunc MaxiSorp Mikrotiterplatten	Fischer	12-565-135	Klebeplatte Abdeckungen können auch durch Fisher bestellt werden
Automatisierte Plattenwäscher
1-Step TMB-Substrat ELISA	Durchstechen	34028	Lagerung bei 4 ° C vorwärmen auf RT vor dem Gebrauch oder als auf dem Datenblatt gerichtet
Mikrotiterplatten-Reader	Bio-Rad-Mikroplatten-Reader (Modell: 680)		Die meisten kolorimetrischen Plattenlesegerät Modelle eignen sich