איתור של פוסט translational שינויים על nucleosomes אינטקט Native ידי ELISA

Summary

הנוקלאוזום ELISA (האיחוד-ELISA) היא שיטה רגישה כמותי כדי לזהות דפוסים גלובליים של הפוסט translational שינויים בהכנות של nucleosomes יליד כנן. שינויים אלה כוללים methylations, acetylations ו phosphorylations על היסטון שאריות חומצת אמינו ספציפית, ולכן האיחוד-ELISA מספק assay proteomic העולמי של המדינות הכולל הכרומטין שינוי של סוגי תאים ספציפיים.

Abstract

הגנום של אאוקריוטים קיימת כמו הכרומטין המכיל גם דנ"א וחלבונים. היחידה הבסיסית של הכרומטין הוא הנוקלאוזום, אשר מכיל 146 זוגות בסיסים של DNA הקשורים עם שני כל אחד ההיסטונים H2A, H2B, H3, H4 ו ^1. N-מסוף הזנבות של ההיסטונים עשירים ליזין ארגינין משתנים שלאחר transcriptionally ידי acetylation, מתילציה, ועוד פוסט translational שינויים (PTMs). תצורת PTM של nucleosomes יכולים להשפיע על פעילות תעתיק של DNA הקשורים, ובכך לספק מצב של ויסות הגנים כי הוא epigenetic בטבע ^2,3. פיתחנו שיטה הנקראת הנוקלאוזום ELISA (האיחוד-ELISA) כדי לקבוע כמותית חתימות PTM גלובלית של nucleosomes שחולצו מן התאים. האיחוד-ELISA רגיש יותר מאשר כמותיים המערבי סופג, והוא שימושי לחקור את המדינה epiproteomic של סוגי תאים ספציפיים. מאמר זה מציג את יומן הווידאו נהלים מפורטים לביצוע האיחוד, ELISA וניתוח.

Protocol

1. תא היונקים תרבות

האיחוד-ELISA יכול להתבצע על כל סוג תא יונקים כי ניתן לגדל בתרבית. אנחנו מעדיפים להכין בינוני קבוצות גדולות של תאים כך nucleosomes ניתן לבודד בכמות מספקת כדי להכין כמה צלחות עמוסות זהה ELISA, ובכך מאפשר מבחני עם נוגדנים שונים (ABS). קשקשים תרבות הבאים מספקים חומר למכביר:

עבור תאים עכבר embyronic גזע, לגדל אחד או שניים 15 ס"מ צלחות של תאים תאים ללא מזין. עבור fibroblasts, לגדול 5-10 צלחות 15 ס"מ עד מפגש.

2. בידוד של גרעינים

הערה: כל הצעדים הם על הקרח עם טרום צונן מאגרים, למעט כפי שצוין.

1. Trypsinize תאים עם טריפסין 3 מ"ל לכל צלחת, לשלב, ולהוסיף 20 מ"ל קר כקרח PBS / בוטיראט. צנטריפוגה בסל"ד 1000 במשך 5 דקות.
2. Resuspend התאים 10 מ"ל PBS / בוטיראט ו צנטריפוגות בסל"ד 1000 במשך 5 דקות.
3. Resuspend במאגר 4 מ"ל תמוגה עם מעכבי פרוטאז (סיגמא אולדריץ P-8340). Dounce homogenize 20 משיכות עם העלי מסוג B על הקרח.
4. צנטריפוגה ב 2000g במשך 10 דקות ב 4 ° C. (Supernatant מכיל הציטופלסמה, אשר אינו נחוץ עבור פרוטוקול זה, אך ניתן לשמור לשימושים אחרים במקרה הצורך).
5. Resuspend גלולה ב 2 מ"ל קרים כקרח לשטוף חיץ C (עם מעכבי פרוטאז).
6. שכבת חומר resuspended על כרית 5 מ"ל סוכרוז 30%, אז צנטריפוגות ב 2400g במשך 5 דקות בתוך הרוטור דלי מתנדנד. גרעינים יעברו דרך כרית, ופסולת נשאר על הממשק.
7. הסר את כל נפח הנוזל בזהירות resuspend את הגרעינים ב 250 μl חיץ קרים לשטוף C + מעכבי פרוטאז.

3. בידוד של nucleosomes ידי באתרו עיכול Micrococcal (MNase) nuclease

אנו משתמשים בהליך שבו הכרומטין מתעכל באתרו בתוך גרעיני על ידי יציקת להם MNase, ואחריו טיפול hypotonic לנהוג nucleosomes שלם חופשי לתוך supernatant.

1. הוסף 3 μl 0.1 M CaCl ₂ המדגם. שים בבלוק 37 חום מעלות צלזיוס. אפשר להניח 37 ° C הטמפרטורה.
2. הוסף 2 יחידות MNase (Micrococcal nuclease, סיגמא אולדריץ, מומס ב 2 units/10μl במאגר MNase), ואז דגירה למשך 37 מעלות צלזיוס למשך 12 דקות, עם ערבוב תדיר באמצעות קצה pipet.
3. הוסף 6 μl של ה-pH M Na-EDTA, 0.5 8.0 להפסיק את התגובה. שימי על הקרח.
4. צנטריפוגה ב 2000g 4 דקות, להשליך supernatant. Resuspend גלולה ב 300 מ"מ 0.2 μl Na-EDTA. חנות על קרח h 1 עם pipeting עדין מדי פעם. (אלה התנאים hypotonic לשחרר nucleosomes ללא גרעינים).
5. צנטריפוגה ב 3000 גרם 4 דקות ב 4 ° C. שמור את supernatant, אשר מכיל nucleosomes חופשי על הקרח.
6. Resuspend שוב את הכדור עם 300 מ"מ 0.2 μl Na-EDTA. חנות על קרח h 1 עם pipeting עדין מדי פעם.
7. צנטריפוגה ב 3000g עבור 4min ב 4 ° C. לשמור על supernatant ולשלב עם supernatant הראשון של שלב 5. ההכנות mononucleosome וכתוצאה מכך ניתן aliquoted ומאוחסנים ב -80 ° C.

הערה: כמות הכרומטין ניתן ונרשמת בגסות על ידי מדידת ספיגת ב 260 ננומטר של המדגם 10 μl הוסיף μl 990 מים. ₂₆₀ = 10 (לאחר התאמה דילול 1 / 100) מתאים על 1mg/ml של הכרומטין. כמו כן, במהלך ההליך הנ"ל, דגימות קטנות עשויה להישמר ונותחו לאחר מכן עבור תוכן ה-DNA שלהם כדי לפקח על איכות והיקף digestions MNase, אשר אמור להכיל בעיקר ה-DNA של 146 נ"ב אורך. Laddering מעיד על העיכול MNase שלם.

הערה: תמונה 1 מכיל סיכום ניתח של בידוד גרעיני digestions צעדים MNase.

4. הנוקלאוזום-ELISA (האיחוד-ELISA)

אנו מזהים PTMs על שברים המכיל nuclesosomes שלם יליד שהיו משותקים על 96 גם צלחות ELISA microtiter. עבור כל דגימה, אנחנו עושים סדרה של פי 2 דילולים, ואלה מצופים על בארות בשלושה עותקים.

1. מעיל MaxiSorp צלחות לילה בשעה 4 ° C עם 50 μl / היטב nucleosomes מדולל חיץ ציפוי. הצעות דילולים כפולה הסידורי של nucleosomes מוכנים מן השורה העליונה אל השורה התחתונה על ידי הוספת 0.1 מיקרוגרם, 0.05 מיקרוגרם, 0.025 מיקרוגרם, 0.0125 מיקרוגרם, 0.00625 מיקרוגרם, 0.00313 מיקרוגרם, 0.00156 מיקרוגרם, עם חיץ ציפוי בלבד (0 הכרומטין מיקרוגרם) בתחתית שורה. (הערה: מכסה צלחת יש צורך בשלב זה.)
2. בבוקר, לשטוף את הצלחות 4 פעמים עם 200% μl / PBS/0.5 גם Tween-20 בטמפרטורת החדר (RT) עבור סכום משולב של 10 דקות עם מכונת כביסה צלחת.
3. בלוק 1 שעות ב RT עם BSA 100 μl / גם Tween-20 / 5% PBS/0.05%.
4. הסר את חוצץ חסימת ידי ניעור צלחת הפוכה במרץמעל לכיור. מכסים ומאחסנים את הצלחות ב -20 ° C, או לעבור ישירות לשלב הבא.
5. הוסף 1 ° Abs בנפח של 50 μl / מדולל היטב 1:1000 (או לפי הצורך) ב% PBS/0.05 Tween-20 / 5% BSA, דגירה על RT במשך שעה 1 על הכתף.
6. לשטוף צלחות 4 פעמים עם 200% μl / PBS/0.5 גם Tween-20 ב RT עבור סך כולל של 10 דקות בתוך מכונת כביסה צלחת.
7. הוסף צנון סוס peroxidase (HRP), מצומדות 2 ° ABS, בדילול 1:5000 (או לפי הצורך) ב% PBS/0.05 Tween-20 / 5% BSA ב RT במשך שעה על הכתף.
8. לשטוף צלחות 4 פעמים עם 200% μl / PBS/0.5 גם Tween-20. לשטוף כל ב RT ו - עבור סכום כולל של 10 דקות עם מכונת כביסה צלחת.
9. לפתח את הצלחות על ידי הוספת 50 μl של המצע TMB היטב כל 10 דקות ב RT. עצור את התגובה על ידי הוספת 50 μl / גם של 2N H ₂ SO ₄ ולקרוא את צלחות 450 ננומטר. (טיפ: צנטריפוגה בסל"ד 1500 דקות 2 באמצעות צלחת הרוטור כדי לפרוק כל בועות האוויר בארות לפני absorbances קריאה).
10. ייצוא קריאות לקבצים גיליון אלקטרוני עבור ניתוחים סטטיסטיים כמותיים.

ריאגנטים

PBS / בוטיראט

135 mM NaCl

2.5 מ"מ KCl

8 מ"מ Na 2 HPO 4

1.5 מ"מ KH 2 PO 4

10 mM Na-בוטיראט

תמוגה הצפת

250 מ"מ סוכרוז

10 mM טריס-HCl, pH 7.4

10 mM Na-בוטיראט

4 מ"מ MgCl 2

0.1% Triton X-100

לשטוף חיץ C

250 מ"מ סוכרוז

10 mM טריס-HCl, pH 7.4

10 mM Na-בוטיראט

4 מ"מ MgCl 2

סוכרוז כריות

30% (w / v) סוכרוז בכביסה חיץ C

Microccocal nuclease הצפת

5 מ"מ נפו 4 חוצץ, pH 7.0

0.025 mM CaCl 2

ציפוי חיץ

הפתרון 80ml + 170ml פתרון B + 250 מ"ל DH 2 O

הפתרון: 0.2 M Na 2 CO 3

פתרון ב ': 0.2 מ' NaHCO 3

5. נציג תוצאות

שימוש בשיטת האיחוד-ELISA, סדרה של הצלחות מספר זהה מוכנים אשר ניתן עמוסה הכרומטין מוכן בצורה של mononucleosomes. אנחנו בדרך כלל מכינים סדרה של צלחות זהה טעון, כך שכל יכול להיות נחקר עם אנטי PTM נוגדנים ספציפיים שונים (ABS). אנחנו גם תמיד להכין צלחת שיכול להיות נחקר עם Ab המאתר ההיסטונים מבלי להתייחס למצב שינוי שלהם לשלוט טעינת מסך הכרומטין. בקרה זו חיונית כדי להשוות מאוחר יותר כמותית תוכן PTM של nucleosomes שהוכן מדגמים שונים. כדי לכמת את רמות PTMs בתוך מדגם הכרומטין נתן לנו לתקן את ערכי ספיגת גלם שימוש בגישה זו: ראשית, אנו לחסר כל אות רקע שימוש בערכים המתקבלים בארות מלאה המכילה לא הכרומטין (רקע זניח בדרך כלל). לאחר מכן, אנו לתקנן PTM ספציפי אותות NU-ELISA לתוצאות שהתקבלו צלחת עמוסה זהה היה assayed עם Ab המאתר nucleosomes תלוי במצב שינוי שלהם. (השתמשנו Abs polyclonal ספציפיות ההיסטונים H2A או H2B למטרה זו). לאחר מכן, אנו לקבוע אמצעים סטיות עבור כל דילול של הכרומטין, ולהשתמש בנתונים המתקבלים החלק הליניארי של assay ELISA. דוגמאות מפורטות של האיחוד-ELISA ניתוחים מתמטיים וסטטיסטיים דווחו בעבר ⁴

באיור 1. Diagam סכמטי של האיחוד-ELISA צעדים. תאים א היונקים נקצרים; גרעינים ב מופרדים על ידי תאים Dounce homogenization, שיבשו ג תאים נטענים על גבי כרית w / v 30% סוכרוז, ד לאחר צנטריפוגה, גרעינים מופקדים גלולה, E, F. הכרומטין מתעכלים באתרו בעיקר על ידי mononucleomes MNase, G, H , אני. mononucleosomes מסיסים מופקים על ידי טיפול hypotonic ו צנטריפוגה חוזרות ונשנות של שאריות חומר גרעיני. Mononucleosomes ג'מ מדגמים שונים (שכותרתו samp. 1 ו -2 במקרה זה) הם מצופים על microtiter בארות סדרת זהה טעון צלחות ונחקרו עם PTM ספציפי ABS ו-PTM Abs עצמאית כדי לקבוע טעינת הכרומטין מוחלט. תיאור של האות ק 'ההפרש רמות גילוי שני מדגמים שונים בתוכן PTM שלהם, עדיין יש הכרומטין הכוללת תוכן דומה, לשפוט לפי immunoreactivity אנטי H2B.

Discussion

האיחוד-ELISA מספק שיטה לברר את מצב גלובלית של PTMs הנוקלאוזום להציג בתוך סוג תא מסוים. האיחוד-ELISA מחקרים הראו כי שינוי גלובלי מדינות הנוקלאוזום שונים השוואות של סוגי תאים מסתעף ^4. בנוסף, האיחוד-ELISA פרופילים PTM להשתנות כאשר התאים נחשפים סוכני modulatory epigenetic כגון trichostatin-A, או כאשר עכבר לתאי גזע embyronic הבדיל ^4. השיטה גם יושמו בהצלחה ללמוד את הכרומטין בתאי גזע עובריים אנושיים ^5. חשוב לציין את האיחוד-ELISA, במתכונתו הנוכחית, יכול לזהות רק את החתימה המשולב של PTMs להציג בתוך לסך של epigenome הסלולר. זה שונה במידה ניכרת מן immunoprecipitation הכרומטין הגנום כולו, אשר יכול לקבוע את חלוקת PTM מסוים על פני לוקוסים גנטיות ספציפיות.

הצעדים הראשונים של נהלי האיחוד-ELISA מותאמים מן השיטות הקודמות לבודד mononucleosomes מן הגרעינים יונקים ^6,7. שיטות אלה מותאמים מספקים דרך אמצעי כדי להשיג איכות גבוהה mononucleosomes שלם מתאי יונקים, ואת השברים וכתוצאה מכך הם מקיפים תוכן הכרומטין שלהם, אבל מכילים הרבה חומרים גרעיניים נוספים. מאז Abs ספציפיים משמשות, מזהמים שאינם nucleosomal חומר נסבל היטב assay NU-ELISA, בניגוד המוני spec גישות הדורשות טוהר יותר. עם זאת, האיחוד-ELISA רגיש יותר מאשר כמותיים המערבי סופג ^4, ובכך לספק חלופות טובות מערבונים ו spec המונית לגילוי PTMs nucleosomal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
Micrococcal Nucleae	סיגמא	N3755	הפוך את aliquots של חיץ 2 U/10μl, המאוחסן ב -20 ° C
Nunc MaxiSorp microtiter פלטות	דיג	12-565-135	מכסה צלחת דבק ניתן גם להזמין דרך פישר
פלייט אוטומטית מכונת כביסה
שלב 1-TMB-ELISA המצע	לנקב	34028	חנות ב 4 ° C טרום חם RT לפני השימוש או כמצוין בגיליון מפרט
Microtiter פלייט Reader	Bio-Rad microplate הקורא (דגם: 680)		רוב colorimetric הקורא מודלים צלחת מתאימים