La detección de modificaciones post-traduccionales de los nativos intactos nucleosomas por ELISA

Resumen

Nucleosoma ELISA (NU-ELISA) es un método sensible y cuantitativo para detectar los patrones globales de modificaciones post-traduccionales en la preparación de los nucleosomas nativos, intacto. Estas modificaciones incluyen metilaciones, acetilaciones y fosforilaciones de residuos de histonas específicas de aminoácidos, y por lo tanto, NU-ELISA proporciona un ensayo global de proteómica de los estados de la modificación general de la cromatina de los tipos de células específicas.

Resumen

El genoma de los eucariotas existe como cromatina que contiene el ADN y las proteínas. La unidad fundamental de la cromatina es el nucleosoma, que contiene 146 pares de bases del ADN asociado con dos cada una de las histonas H2A, H2B, H3, H4 y ^1. Las colas N-terminal de las histonas son ricas en lisina y arginina y se modifican después de la transcripción por acetilación, metilación y otras modificaciones post-traduccionales (PTM). La configuración de la polilla de los nucleosomas pueden afectar la actividad transcripcional del ADN asociadas, proporcionando así un modo de regulación de los genes epigenéticos que es de naturaleza ^2,3. Hemos desarrollado un método llamado ELISA nucleosoma (NU-ELISA) para determinar cuantitativamente las firmas globales PTM de los nucleosomas extraído de células. NU-ELISA es más sensible y cuantitativo de Western Blot, y es útil para interrogar el estado epiproteomic de tipos de células específicas. Este artículo de la revista video muestra a los procedimientos detallados para llevar a cabo análisis de NU-ELISA.

Protocolo

1. Cultivo de células mamíferas

NU-ELISA se puede realizar en cualquier tipo de células de mamíferos que pueden ser cultivadas en la cultura. Nosotros preferimos preparar moderada a grandes cantidades de células, de modo que los nucleosomas se pueden aislar en cantidad suficiente para preparar varios idéntica carga placas de ELISA, lo que permite ensayos con varios anticuerpos diferentes (Abs). Las escalas de la cultura después de ofrecer gran cantidad de material:

Para que las células madre de ratón embyronic, crecen uno o dos placas de 15 cm de células sin células alimentadoras. Para los fibroblastos, crecer 5 a 10 cm 15 placas a la confluencia.

2. El aislamiento de los núcleos

Nota: Todos los pasos están en el hielo con el pre-enfriado tampones, excepto lo indicado.

1. Trypsinize células con 3 ml de tripsina por placa, combinar y agregar 20 ml de helado de PBS / butirato. Centrifugar a 1000 rpm durante 5 min.
2. Resuspender las células en 10 ml de PBS / butirato y centrifugar a 1000 rpm durante 5 min.
3. Resuspender en 4 ml de tampón de lisis con inhibidores de la proteasa (Sigma-Aldrich P-8340). Dounce homogeneizar 20 golpes con mortero tipo B en el hielo.
4. Centrifugar a 2000 g durante 10 min a 4 ° C. (El sobrenadante contiene el citoplasma, que no es necesario para este protocolo, pero se pueden guardar para otros usos si se desea).
5. Resuspender el precipitado en 2 ml de hielo frío tampón de lavado C (con inhibidores de la proteasa).
6. Capa del material resuspendido en 5 ml colchón de sacarosa al 30% y centrifugar a 2400g durante 5 minutos en un rotor basculante. Los núcleos se migran a través de cojín, y los escombros se mantiene en la interfaz.
7. Eliminar todo el volumen de líquido con cuidado y volver a suspender los núcleos de hielo de 250 l de tampón de lavado en frío C + inhibidores de la proteasa.

3. Aislamiento de los nucleosomas in situ por micrococcal nucleasa (MNase) Digestión

Utilizamos un procedimiento en el cual se digiere la cromatina in situ dentro de los núcleos mediante la infusión con MNase, seguido de un tratamiento hipotónico para conducir sin nucleosomas intacta en el sobrenadante.

1. Añadir 3 l 0,1 M CaCl ₂ a la muestra. Puesto en 37 ° C del bloque de calor. Permiten suponer 37 ° C de temperatura.
2. Añadir 2 unidades MNase (micrococcal nucleasa, Sigma-Aldrich, disuelto en 2 units/10μl en tampón MNase), a continuación, se incuba durante a 37 ° C durante 12 minutos, mezclando frecuentemente utilizando una punta de pipeta.
3. Añadir 6 l de 0,5 M Na-EDTA, pH 8,0 para detener la reacción. Poner en hielo.
4. Centrifugar a 2000 g durante 4 minutos, desechar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 300 l 0,2 mM Na-EDTA. Guárdelo en hielo durante 1 h con pipeta suave ocasional. (Estas condiciones hipotónicas liberar a los nucleosomas libres de los núcleos).
5. Centrifugar a 3000 g durante 4 min a 4 ° C. Guardar el sobrenadante, que contiene nucleosomas libre, en el hielo.
6. Resuspender el precipitado de nuevo con 300 l 0,2 mM Na-EDTA. Guárdelo en hielo durante 1 h con pipeta suave ocasional.
7. Centrifugar a 3000 g de 4 minutos a 4 ° C. Conserve el sobrenadante y se combinan con el primer sobrenadante del paso 5. Las preparaciones resultantes mononucleosome puede alícuotas y almacenados a -80 ° C.

Nota: La cantidad de cromatina puede ser cuantificada por la crudeza de medir la absorbancia a 260 nm de una muestra de 10 l añadido a 990 l de agua. A ₂₆₀ = 10 (después de ajustar por la dilución 1 / 100) corresponde a cerca de 1mg/ml de la cromatina. Además, durante el procedimiento anterior, las muestras pequeñas pueden ser retenidos y luego se analiza su contenido de ADN para controlar la calidad y el alcance de las digestiones MNase, que principalmente debe contener ADN de 146 pb de longitud. Escala es un indicativo de la digestión incompleta MNase.

Nota: la figura 1 contiene un resumen diagramado de aislamiento nuclear y las medidas digestiones MNase.

4. Nucleosoma-ELISA (NU-ELISA)

Detectamos PTM en las fracciones que contengan especies nativas nuclesosomes intactos que se han inmovilizado en placas de 96 pocillos de microtitulación de ELISA. Para cada muestra, se hace una serie de dos diluciones, y estos están cubiertos en los pozos por triplicado.

1. Escudo MaxiSorp la noche a 4 ° C con 50 l / pocillo de los nucleosomas diluido en tampón de recubrimiento. Placas Sugiere diluciones en serie de los nucleosomas se preparan a partir de la fila superior de la fila inferior mediante la adición de 0,1 mg, 0,05 mg, 0.025 mg, 0,0125 g, mg 0,00625, 0,00313 g, mg 0,00156, con tampón de recubrimiento sólo (0 cromatina mg) en la parte inferior fila. (Nota: cubiertas de la placa son necesarias para este paso.)
2. Por la mañana, lavar los platos cuatro veces con 200 l / pocillo PBS/0.5% Tween-20 a temperatura ambiente (TA) para un total combinado de 10 minutos con un lavador de placas.
3. Bloque 1 hora a temperatura ambiente con 100 l / pocillo PBS/0.05% Tween-20 / 5% de BSA.
4. Retire el amortiguador de bloqueo agitando la placa invertida rápidamentesobre un fregadero. Cubra y guarde las placas a -20 ° C, o ir directamente al siguiente paso.
5. Añadir 1 ° Abs en un volumen de 50 l / pocillo diluido 1:1000 (o según sea necesario) en PBS/0.05% Tween-20 / 5% de BSA, se incuban a temperatura ambiente durante 1 hora en un rotor.
6. Lavar las placas 4 veces con 200 l / pocillo PBS/0.5% Tween-20 a temperatura ambiente y por un total combinado de 10 minutos en un lavador de placas.
7. Añadir peroxidasa de rábano picante (HRP) y conjugado con 2 º Abs, diluido 1:5000 (o según sea necesario) en PBS/0.05% Tween-20 / 5% de BSA a temperatura ambiente durante una hora en un rotor.
8. Lavar las placas 4 veces con 200 l / pocillo PBS/0.5% Tween-20. Cada lavado es a temperatura ambiente y por un total de 10 minutos con un lavador de placas.
9. Desarrollar las placas mediante la adición de 50 l de sustrato TMB a cada pocillo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Detener la reacción añadiendo 50 l / pocillo de H 2 N ₂ SO ₄ y leer las placas de 450 nm. (Consejo: Se centrifuga a 1500 rpm durante 2 minutos con un rotor de placas para disipar cualquier burbuja de aire en los pozos antes de absorbancias de lectura).
10. Exportación de las lecturas de los archivos de hoja de cálculo para el análisis cuantitativo y estadístico.

Reactivos

PBS / butirato

135 mM NaCl

2,5 mM de KCl

8 mM Na 2 HPO 4

1,5 mM KH 2 PO 4

10 mM Na-butirato

Tampón de lisis

250 mM sacarosa

10 mM Tris-HCl, pH 7,4

10 mM Na-butirato

4 mM de MgCl 2

0,1% Triton X-100

El tampón de lavado C

250 mM sacarosa

10 mM Tris-HCl, pH 7,4

10 mM Na-butirato

4 mM de MgCl 2

Sacarosa cojín

30% (w / v) de sacarosa en tampón de lavado C

Microccocal nucleasa Buffer

5 mM NaPO 4 tampón, pH 7,0

0,025 mM CaCl 2

Revestimiento de amortiguación

Solución de 80 ml ​​de A + B + 170ml de solución 250ml dH 2 O

Solución A: 0,2 M Na 2 CO 3

Solución B: 0,2 M NaHCO 3

5. Resultados representante

Utilizando el método ELISA-NU, una serie de varias placas idénticas están preparados que se pueden cargar con la cromatina preparados en forma de mononucleosomes. Por lo general preparar una serie de placas cargadas de idéntico modo que cada uno se puede probar con diferentes anti-PTM anticuerpos específicos (Abs). Además, siempre preparar un plato que se puede probar con un Ab que detecta las histonas, independientemente de su estado de modificación total control de la cromatina de carga. Este control es esencial para luego comparar cuantitativamente el contenido de los nucleosomas PTM preparado a partir de diferentes muestras. Para cuantificar los niveles de PTM dentro de una muestra de la cromatina dado que corregir los valores de absorbancia primas que utilizan este enfoque: en primer lugar, se le resta cualquier señal de fondo con los valores obtenidos de los pozos de control que no contiene la cromatina (de fondo suele ser insignificante). A continuación, estandarizar PTM señales específicas de NU-ELISA los resultados obtenidos a partir de una placa idéntica carga que se ensayó con un Ab que detecta los nucleosomas independiente de su estado de modificación. (Hemos utilizado Abs policlonales específicos para las histonas H2A y H2B para este propósito). A continuación, determinar los medios y las varianzas para cada dilución de la cromatina, y el uso de los datos obtenidos de la parte lineal de la prueba de ELISA. Ejemplos detallados de NU-ELISA análisis matemáticos y estadísticos han sido reportados previamente ⁴

Figura 1. Esquemática diagam de NU-ELISA pasos. Las células de mamíferos se cosechan A., B. Los núcleos están separados de las células por Dounce homogenization, C. Interrupción células se cargan en la parte superior de un colchón de sacarosa al 30% w / v, D. Después de la centrifugación, los núcleos se depositan en el sedimento, E, F. cromatina son digeridos in situ a mononucleomes predominantemente por MNase, G, H , yo. mononucleosomes solubles son extraídos por tratamiento hipotónico y centrifugación repetida de material nuclear residual. Mononucleosomes J. partir de diferentes muestras (con la etiqueta samp. 1 y 2 en este caso) están recubiertos en pocillos de microtitulación en serie de forma idéntica carga placas e interrogado en PTM-específicas Abs Abs y PTM-independiente para determinar la carga total de la cromatina. Representación K. de los diferentes niveles de detección de señales en dos muestras que difieren en su contenido PTM, sin embargo, tienen un contenido similar de la cromatina en general, a juzgar por los anti-H2B inmunoreactividad.

Discusión

NU-ELISA proporciona un método para determinar el estado global de la PTM nucleosoma presente dentro de un tipo de célula particular. NU-ELISA estudios han demostrado que la modificación global de los estados nucleosoma difieren en las comparaciones de tipos de células divergentes ^4. Además, NU-ELISA perfiles PTM cambiar cuando las células están expuestas a los agentes moduladores epigenéticos como la tricostatina A o cuando el ratón las células madre se diferencian embyronic ^4. El método ha sido aplicado con éxito para estudiar la cromatina de células madre embrionarias humanas ^5. Es importante tener en cuenta la NU-ELISA, en su forma actual, sólo puede detectar la firma del PTM compuesto presente en la suma total de la epigenoma celular. Esto difiere notablemente de todo el genoma inmunoprecipitación de cromatina, que puede determinar la distribución de un PTM específicos a través de loci genéticos específicos.

Los primeros pasos de los procedimientos de NU-ELISA son una adaptación de los métodos anteriores para aislar mononucleosomes de los núcleos de mamíferos ^6,7. Estos métodos adaptados proporcionan una manera conveniente de obtener alta calidad mononucleosomes intacta a partir de células de mamíferos, y las fracciones resultantes se completa en su contenido de la cromatina, pero contienen una gran cantidad de materiales nucleares adicionales. Desde Abs específicos se utilizan, la contaminación no nucleosomal material es bien tolerado en el ensayo de NU-ELISA, a diferencia de la masa de las especificaciones enfoques que requieren una mayor pureza. Sin embargo, NU-ELISA es más sensible y cuantitativo de Western Blot ^4, proporcionando así una buena alternativa a los westerns y espectrómetro de masas para la detección de PTM nucleosomal.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Micrococcal Nucleae	Sigma	N3755	Hacer alícuotas de 2 buffer U/10μl, almacenadas a -20 ° C
Nunc MaxiSorp placas de microtitulación	Pescador	12-565-135	Cubre la placa adhesiva también se pueden solicitar a través de Fisher
Lavadora automática de placas
Paso 1-TMB-ELISA sustrato	Atravesar	34028	Almacenar a 4 ° C antes de calentar a TA antes de su uso o como se indica en la hoja de especificaciones
Lector de Placas de microtitulación	Bio-Rad lector de microplacas (modelo 680)		La mayoría de los modelos colorimétricos lector de placas son adecuadas