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摘要

量化血浆中HIV - 1 RNA水平和测序单一的HIV - 1病毒载量低于检测限（50-75拷贝/ ml）与个人的基因组是困难的。在这里，我们描述了如何提取和量化使用实时PCR检测方法能够可靠措施，HIV - 1 RNA下降到0.3拷贝/ ml，以及如何放大由单一的基因组测序的病毒基因组病毒载量非常低的样品，血浆病毒RNA。

摘要

，获得患者的洞察力病毒动态和病毒宿主相互作用，病毒基因放大和量化，在HIV - 1病毒载量低于检测标准检测的限制（低于50-75拷贝/ ml）感染者HIV - 1 RNA是必要的日志自然控制的感染和抗逆转录病毒联合疗法（CART）的那些。

在这里，我们介绍了如何由单一的基因组测序（SGS协议）13，19和如何准确地量化在与病毒载量低（单拷贝检测（SCA）协议）12，20的患者的HIV - 1 RNA病毒的基因组扩增。

单拷贝检测的实时PCR检测的灵敏度取决于被检测血浆量。如果一个单一的病毒基因组是7毫升血浆中检测到，然后报道RNA拷贝数为0.3拷贝/ ml。该检测RNA提取效率的内部控制测试，并可能扩增DNA或污染控制。测量患者样本一式三份。

，现在已经广泛使用，被视为非劳动密集的3，7，12，14，15的单基因组测序法（SGS）的，是一个限制的稀释检测，其中端点cDNA产物稀释96孔蔓延板。根据泊松分布，不到1 / 3的水井时给予的产品，有一个80％的机会的PCR产物被放大的结果，从一个单一的基因分子。 SGS已超过克隆没有受到重采样和PCR引入重组19偏颇的优势。然而，SCA和SGS的扩增成功取决于引物的设计。两种检测为HIV - 1 B亚型，但可以适应不断变化的引物，探针和标准的其他亚型和基因组的其他地区。

研究方案

1。从大量的血浆提取的RNA

在图1和2提供了一个单拷贝检测（SCA）的概述和单基因组测序（SGS）的协议。

  1. 要获得7毫升血浆，旋转约14毫升的血液收集在15毫升EDTA，15分钟，在2600 XG（肝素）无制动收集管。移液器（一定要避免巴菲涂层）为15毫升管的血浆。
  2. 如果RNA是单拷贝检测（SCA），秒杀Rous肉瘤病毒内部的病毒粒子控制（RCAS）30000份血浆中提取。 RCAS病毒前准备执行政制事务局局长如前所述（20）。简言之，通过RT活性量化RCAS病毒从细胞培养上清，稀释至终浓度的每200 UL 30000的病毒颗粒，含5％FBS的RPMI组织培养基稀释，并储存于-80 ° C在单一使用等份。 RCAS病毒不应该被冻结/解冻之前，在实验中使用。 RCAS添加到患者血浆RNA提取的效率和精度的PCR定量控制。在下面的链接： http://home.ncifcrf.gov/hivdrp/RCAS/可以找到更多关于合会的信息。
  3. “预旋”等离子，15毫升锥形离心管中，在2600 XG 15分钟，分离出任何脂类和细胞碎片，它可以干扰RNA定量准确。
  4. 标签西顿易于密封的永久性标记，以确定样本数和颗粒的位置将形成管离心管。前自旋后，转让等离子到西顿易于密封的离心管中，吹打的血浆，并避免在表面上的任何细胞碎片和/或血脂。记录血浆的输入量。
  5. 添加的Tris缓冲液（TBS），以填补剩余量的西顿简易封管螺纹脖子底部。确保无气泡，目前在管或管会崩溃的超速离心机。确保管的标志是朝外管放入转子。
  6. 密封可重复使用的瓶盖和一个预冷Sorval T1270转子和Sorval 170000 XG（50,000 RPM）在4 ° C为30分钟90SE超速离心机离心机样本。
  7. 离心后除去上清液和添加90 UL分子级的水和10 UL蛋白酶K（20毫克/毫升）病毒颗粒（这将是不可见的的）。
  8. 在55 ° C水浴30分钟孵化广场管。确保管一边是沉浸在蛋白酶K和水的混合物，使沉淀的角度。
  9. 孵化后不久，在表离心机旋转管，收集所有液体的试管底部（约5秒），并添加315 UL 6M胍硫氰酸解决方案和10 UL 20毫克/毫升糖原（注：按照适当的这种有害物质的处置准则;不使用漂白剂或酸混合，丢弃在单独的容器 ） 。
  10. 涡轻轻旋不久（约5秒）。在室温下孵育10分钟，然后各管的内容传送到一个​​新标记的1.5毫升核糖核酸酶免费离心管。
  11. 495 UL的分子级异丙醇添加到每个管，离心旋涡10秒，在室温为30分钟，在21000 XG。
  12. 弃上清，和70％的乙醇添加500 UL。
  13. 21000 XG用于在室温下15分钟10秒和离心旋涡。取出用移液管的乙醇。再次旋转和删除任何残留的乙醇用移液器。空气干燥10分钟。 （SGS的协议溶于40 5毫米的Tris - HCl pH值8.0 UL的RNA，并继续与SGS协议）。
  14. 55 RNA缓冲UL溶解沉淀。 RNA缓冲是通过添加10 UL 100毫米的DTT和25 Rnasin 40 U / UL UL 965 UL的Tris - HCl（pH值8.0，5毫米）。置于冰上。

2。单拷贝检测

一个96孔板拥有8患者的样本，包括艾滋病毒和RCAS标准和控制。该协议将描述一个单盘的设置。

  1. 开始准备2 1毫升RNA缓冲区中的HIV - 1的RNA和RCAS RNA转录的RNA标准曲线将稀释分装。 RNA缓冲描述下1.13。
  2. 准备在2毫升离心管冰稀释。加入的HIV - 1 RNA的股票（1 × 10 6份/ UL）的25到54 UL RNA 缓冲3x10 5份/ UL UL一半的HIV - 1 RNA的RNA缓冲记录日志稀释。
  3. 继续通过连续的半对数的稀释（25 UL + 54 UL）下降到0.3份每10 UL（注：0.3，1，3稀释将不会在这些分析的标准曲线的一部分被用作推断值并应设置为未知数DURING的分析）。 RCAS成绩单的放养密度为1 × 10 6份/ UL。同样，准备在RNA缓冲RCAS笔录半日志稀释，但每10 UL下降到100份。
  4. 准备如表1所列的cDNA合成的RT鸡尾酒。准备RT和牢记，以弥补一点额外的考虑了在传输过程中可能发生的任何损失，如表1所列的尼古丁替代疗法的反应。注：为尼古丁替代疗法的鸡尾酒，逆转录酶是由水所取代，以控制从DNA扩增。
    注意：此步骤最近一直在钢板上Qiagen公司的机器人（原本科贝特）设立自动化。
  5. 设置光学96孔板（如图3所示），每口井的RT反应混合物中加入20 UL。在标记的8口井的“尼古丁替代疗法”，添加没有逆转录酶（简称NRT反应混合物）的鸡尾酒。加入鸡尾酒板后，加水10 UL井标有“无模板对照（NTC）的”。 10艾滋病毒成绩单UL标记为“人类免疫力缺乏病毒（HIV）”，如图3所示的浓度井。 10 RCAS笔录UL标有“RCAS”根据浓度的水井。添加在板图上标有“样品”的3个相邻井的10个患者样本UL。洗脱样品，加入10 UL标记的井“尼古丁替代疗法”。新增5 UL同一样品和5水UL标记的井“内部人控制”。
  6. 密封板和热循环仪上运行：25 ° C为15分钟，42 ° C时40分钟，85℃10分钟，25℃30分钟和5 ° C举行。
  7. 准备PCR扩增混合，按表2。
  8. 当cDNA合成完成后，移动到指定的区域，利用cDNA。在此指定的区域中，添加20 PCR扩增预混UL以及每个艾滋病毒和RCAS的cDNA板。重要的是要在指定的区域中执行此步骤，以避免任何可能污染。
  9. 旋转盘，ABI或罗氏光学与光毯（毯只有必要的ABI 7700）盖盖和密封。罗氏480或ABI的7700上运行。 PCR条件：95℃10分钟，然后45个循环95 ° C，持续15秒，60 ° C为1分钟。 RCAS和艾滋病毒进行单独的分析是必需的。如图4所示的结果的例子。一个正常的低拷贝数笔录泊松分布的标准曲线的斜率会受到影响。为了确保最准确的斜坡，作标准曲线，这些低拷贝数的标准（0.3，1和3份）为“未知” 。17

3。单基因组测序

  1. cDNA合成。加入UL的10毫米dNTPs和5 5 2毫米的基因特异性引物（POL或 env）良好的UL在一个96孔PCR板（BIORAD） 。新增40所提取的RNA UL。密封板。
  2. 在热循环中的RNA混合物在65 ° C变性10分钟。
  3. 混合cDNA合成，表3中所列的试剂。变性步骤后，放置在冰PCR板，每个样品中添加50 UL的cDNA混合物。
  4. 运行PCR板热循环：45 ° C为50分钟，85 ° C为10分钟和4 ° C举行。
  5. 第一次PCR，10 UL反应。准备PCR反应试剂托盘在使用P6 - RT或 env（表3中所列的试剂，在表5中列出的引物）的第一轮扩增引物。
  6. 使用多道移液器免除8.0 PCR混合物73口井的UL 96孔PCR板（70个样本和3个阴性对照）。
  7. cDNA合成完成后，移动的cDNA和PCR板，PCR反应混合物中含有利用cDNA指定的区域。在指定的区域中，添加40的Tris - HCl pH值8.0的UL每个cDNA样本，使终体积为140 UL。添加2.0 cDNA的UL 70口井的水和2.0 UL，每个阴性对照。密封PCR板。热循环，计划在表4上运行。
  8. 巢式PCR - 20ul反应。混合试剂托盘（表3中所列的试剂，在表5中列出的引物）的巢式PCR试剂。
  9. 18 UL的巢式PCR混合物添加一个96孔PCR板73口井，多道移液器
  10. 第一次PCR 1:5稀释，加2 UL第一轮PCR巢式PCR。运行PCR反应的热循环，表4中列出的条件下，。
  11. 1％琼脂糖凝胶上运行的样本。为了确保大多数的PCR产物是一个单分子的cDNA的结果，不超过30％的水井应是积极的。该工艺已使用贝克曼Biomek调频机器人自动加载的内容，以1％的PCR板，96孔E -凝胶（Invitrogen公司）。 E -凝胶是运行在E -基地为7分钟。使用表5中列出的引物的序列产品。

4。代表性的成果：

政制事务局局长：

所有的控制应以正确考虑测量的HIV - 1 RNA传递。如果阴性对照positiVE，运行应该被忽视，因为可能的污染。为了控制损失的RNA提取步骤，至少有50％的添加血浆中的合会应收回。如果平均RCAS <15000份，样品失败，并应被忽略，因为相当数量的RNA可以在提取或该协议的其他步骤丢失。这发生在约10％，所有患者的样本测试，可能是由于高血脂在血浆6。 RCAS病毒的复苏，是为了控制质量的提取和cDNA合成和PCR扩增效率。它不是用于艾滋病毒恢复正确的，因为艾滋病毒有可能略有不同的组织培养分离病毒的免疫球蛋白和其他人类蛋白的约束。在我们的实验室合会的恢复平均25,716 + / - 4057拷贝/反应混合物，或约95％+ / -15％的RCAS RNA添上17 。净吨（无逆转录酶）控制并行运行，以测试从DNA扩增。的NRT值是每三个HIV - 1 RNA值相减，然后平均计算，如果这个数字是小于零（DNA扩增超过RNA扩增），其结果必然失败，应该被忽视，因为而不是RNA的DNA扩增的风险。如果HIV - 1 RNA只有1 / 3口井的放大，重新测试样品的建议，以确保扩增是真正的实际样品被检测，而不是由于一个可能的污染物。

如果通过了​​所有的控制，HIV - 1的平均血浆中的RNA拷贝数可以计算的。

例1：如果平均HIV - 1病毒的拷贝数是零，检测限检测血浆量的基础上计算。作为一个例子，比方说，7毫升血浆检测。本来可以用这个实验中发现的RNA的量最小，本来1份，平均每口井0.33副本的其他两个井的井和0份之一。然后由RNA的洗脱总套数（有10 UL在每口井，但总的洗脱体积为55 UL）为5.5倍乘以平均拷贝数。然后检测下限：5.5 × 0.33除以7毫升= 1.83 / 7 = 0.3拷贝/ ml的副本。在这个例子中的HIV - 1 RNA的血药浓度<0.3拷贝/ ml。

例2：HIV - 1病毒RNA被觉察。 RNA提取从7毫升血浆。 HIV - 1 RNA每平均拷​​贝数以及计算为2.0％，以及副本。然后，每毫升血浆的平均拷贝数为5.5毫升× 2.0份/ 7 = 1.6 HIV - 1的RNA /毫升血浆。

模板Excel工作表来计算拷贝数可以从网站上下载。

SGS：

如果一个阴性对照的是积极的运行应该被忽视，由于可能的污染。从每个运行的产品的数量将取决于每个样本中的病毒载量和样本的条件。根据我们的经验，很多血浆中的脂类或细胞会减少获得产品的机会。储存条件和以前的冻结和解冻的样品，还将大大影响RNA的复苏。在一般情况下，与病毒载量低于50拷贝/ ml，产品（凝胶波段）的样品时，预计将在约1 / 3 -1 / 2处理的样品。根据上述因素，每盘1-5条带应被视为一个很好的结果，由于在这些患者中的低的病毒载量。

合成cDNA（RT鸡尾酒/ cDNA反应） 1反应无逆转录酶（NRT）的鸡尾酒/ cDNA的反应（反应）
分子级H 2 O 8.1 UL 8.2 UL
25毫米氯化镁2 6 UL 6 UL
25毫米dNTPs 0.6 UL 0.6 UL
100 mM的数码地面电视 0.2 UL 0.2 UL
随机六聚体（0.1微克/ UL） 1.5 UL 1.5 UL
10X的TaqMan缓冲液A 3.0 UL 3.0 UL
Rnasin（40 U / UL） 0.5 UL 0.5 UL
Strategene RT（200 U / UL） 0.1 UL 不添加
共有 20 UL 20 UL
样品的RNA 10 UL 10 UL
总成交量 30 UL 30 UL

表1反应mixtURES在单拷贝含量的cDNA合成。

PCR扩增预混 1反应 底漆
H 2 O 15.1 UL 艾滋病毒正向引物5' - CATGTTTTCAGCATTATCAGAAGGA - 3'
10X PCR检测金缓冲区 2.0 UL 艾滋病毒的反向引物5' - TGCTTGATGTCCCCCCACT - 3'
25毫米氯化镁2 2.0 UL 艾滋病毒Probe5'FAM CCACCCCACAAGATTTAAACACCATGCTAA TAMRA 3“
*正向引物（100 UM） 0.3 UL
*反向引物（100 UM） 0.3 UL RCAS正向Primer5' - GTCAATAGAGAGAGGGATGGACAAA 3“
*探头（100 UM） 0.05 UL 合会反向Primer5' - TCCACAAGTGTAGCAGAGCCC 3'
TaqGold（5 U / UL） 0.25 UL RCAS探头5'FAM TGGGTCGGGTGGTCGTGCC - TAMRA 3'
共有 20.0 UL

见表2。PCR扩增预混试剂和引物进行单拷贝含量。

cDNA的鸡尾酒/ cDNA的反应 1 RNA样品 第一次PCR扩增鸡尾酒 1板（75反应） 巢式PCR检测鸡尾酒 1板（75反应）
10X RT缓冲液（Invitrogen公司） 10 UL 10X PCR缓冲液（Invitrogen公司） 75 UL 10X PCR缓冲液 150 UL
25毫米氯化镁2 20 UL 50毫米硫酸镁 30 UL 50毫米硫酸镁 60 UL
0.1M的数码地面电视 1 UL 10毫米dNTPs 15 UL 10毫米dNTPs 30 UL
无RNase水 17.5 UL 50 UM引物（EA） 3 UL 50 UM引物（EA） 6 UL
RNase的输出（Invitrogen公司） 1 UL 白金Taq酶的Hi - Fi酶（Invitrogen公司） 6 UL 白金Taq酶的Hi - Fi酶（Invitrogen公司） 12 UL
三标（200 U / UL）（Invitrogen公司） 0.5 UL 分子级水 468 UL 分子级水 1086 UL

表1的cDNA和单基因组测序的PCR混合物。

P6 - RT PCR程序 环境保护1 PCR程序
1。 94℃2分钟 1。 94℃2分钟
2。 94℃30秒 2 0.94 ° C为30秒
2 0.94 ° C为30秒 3。 52℃30秒
4。 72℃1分30秒 4。 72℃1分钟
5。 ＃2，44个循环 5。 ＃2，44个循环
6。 72℃3分钟 6。 72℃3分钟
7。 4℃举行 7。 4℃举行
P6 - RT 2 PCR程序 环境保护2 PCR程序
1。 94℃2分钟 1。 94℃2分钟
2。 94℃30秒 2。 94℃30秒
3。 55℃30秒 3。 56℃30秒
4。 72℃1分钟 4。 72℃45秒
5。 ＃1，40（共41周期） 5。 ＃1，40（共41周期）
6。 72℃3分钟 6。 72℃3分钟
7。 4℃举行 7。 4℃举行

表4热循环条件为单基因组测序分析。

反应 底漆 序列
P6 - RT基因cDNA 3500 - 5'CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3'
ENV基因 E115 - 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3“
P6 - RT 1。 PCR扩增 3500 - 5'CTATTAAGTATTTTGATGGGTCATAA 3'
P6 - RT 1。 PCR扩增 1849 + 5'GATGACAGCATGTCAGGGAG 3'
P6 - RT2.PCR 1870年+ 5'GAGTTTTGGCTGAGGCAATGAG 3'
P6 - RT 2.PCR 3410 - 5'CAGTTAGTGGTATTACTTCTGTTAGTGCTT 3'
ENV 1。 PCR扩增 E115 - 5'AGAAAAATTCCCCTCCACAATTAA 3“
ENV 1。 PCR扩增 E20 + 5'GGGCCACACATGCCTGTGTACCCACAG 3“
ENV 2。 PCR扩增 E30 + 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3“
ENV 2。 PCR扩增 E125 - 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3“
P6 - RT测序 2030 + 5'TGTTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC 3“
P6 - RT测序 2600 +的 5'ATGGCCCAAAAGTTAAACAATGGC3“
P6 - RT测序 2610 - 5'TTCTTCTGTCAATGGCCATTGTTTAAC3“
P6 - RT测序 3330 - 5'TTGCCCAATTCAATTTTCCCACTAA 3“
ENV测序 E30 + 5'GTGTACCCACAGACCCCAGCCCACAAG3“
ENV测序 E125 - 5'CAATTTCTGGGTCCCCTCCTGAGG 3“

表5。引物为单基因组测序分析。

figure-protocol-11203
图1。辛格基因组测序检测（SGS）的概述。

figure-protocol-11335
图2单拷贝含量（SCA）的概述。

figure-protocol-11462
图3。板设置为单拷贝检测。

figure-protocol-11586
图4：从ABI拍摄的画面7700。 A.显示病人样本和B. RCAS标准曲线呈现出飙升的患者样本的HIV - 1 RNA标准曲线。

讨论

艾滋病毒1感染者抗逆转录病毒药物联合治疗（车）或自然控制感染病毒载量非常低，通常约1副本每毫升血浆4，11，12，17，18。自然控制患者的病毒载量，往往个人设置1，2，17点左右波动。检测的灵敏度，此处所描述的高度依赖的血浆输入量。一般来说，我们已与7毫升血浆，但取得了积极的成果，可以从少量的血浆，以及根据实际血浆病毒载量。此处所描述的RNA提取方法“，这?...

披露声明

没有利益冲突的声明。

致谢

作者要感谢的患者参加的HIV - 1的许多研究。

江铃汽车的FM柯比基金会的支持下与美国癌症协会的研究教授。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
试剂名称 公司 目录编号 评论
随机六聚体（500微克/毫升） Promega公司 C118A
TaqMan探针缓冲液A 应用生物系统公司 4304441
RNAsin（40 U / UL） Promega公司 N211B
逆转录酶（200 U / UL） Strategene 600107-51
Amplitaq黄金DNA聚合酶应用生物系统公司 4311814 6包
Amplitaq 10XGold PCR缓冲液II 应用生物系统公司 4311814 带有的酶
Magnesiumcloride 25毫米应用生物系统公司 4311814 带有的酶
1M的Tris - HCl缓冲液，pH 8.0，5毫米 Invitrogen公司 AM9855G
标III逆转录酶200 U / UL Invitrogen公司 18080-044
标三10X缓冲 Invitrogen公司带有的酶
数码地面电视100毫米 Invitrogen公司带有的酶
白金Taq DNA聚合酶高保真5 U / UL Invitrogen公司 11304-102
10X高保真PCR缓冲液 Invitrogen公司 11304-102 带有的酶
蛋白酶K 20毫克/毫升 Ambion公司 2546
胍硫氰酸解决方案6M FlukaBiochemica 50983
糖原20​​毫克/毫升罗氏公司 10901393001
异丙醇 Sigma - Aldrich公司 19516
乙醇70％ Sigma - Aldrich公司 E702 - 3
分子级水 GIBCO / Invitrogen公司 10977-015
dNTPs（各25毫摩尔） Bioline BIO - 39025
对Euipment名称 公司 目录编号 评论
易密封离心管（16x73mm） 西顿科学 6041
白聚甲醛树脂冠西顿科学 4020 简易的密封管的上限
试管架Optiseal钟顶管，8.9毫升贝克曼 361642
六角螺丝刀4.5公司开放西顿科学 4013
盖帽拆除tupe 西顿科学 4014
5毫升的血清移液器配角 4051
Pipetboy 任何
15毫升转移移液器 ISC的Bioexpress P - 5005 - 7
5.8毫升Dispossable转移移液器，精尖 VWR 14670-329
15 mL离心管鹘
1 mL离心管任何
Tris缓冲盐水片 Sigma - Aldrich公司 T5030 - 100TAB
超速离心机和转子 Sorval 90SE和T - 1270
96孔PCR板 BIORAD HSS - 9601
50毫升的试剂水库配角 4870
微安光学96孔反应板应用生物系统公司 N801 - 0560
光板覆盖应用生物系统公司 4333183
微安光学压缩垫应用生物系统公司 4312639
MicrosealA片 BIORAD MSA - 5001
2毫升离心管任何
1％琼脂糖凝胶（E -凝胶，Invitrogen公司） Invitrogen公司 G - 7008 - 01
电子基地（Invitrogen公司） Invitrogen公司 EB - M03

EDTA的收集管任何品牌

参考文献

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