Hsp104纯化，蛋白质Disaggregase

摘要

在这里，我们描述一个高度活跃Hsp104，一个六聚AAA +从酵母中的蛋白质，其中夫妇ATP水解蛋白分解净化的协议。该计划利用从亲和纯化His6标签的​​构造 E。大肠杆菌其次，His6标签去除TEV蛋白酶，体积排阻色谱阴离子交换层析。

摘要

Hsp104是一个六聚AAA +蛋白^1，从酵母，这夫妇ATP水解蛋白质分解^2-10（图1）。这个活动赋予了两个关键的选择性优势。首先，由Hsp104无序聚集复性酵母生存的授权后，各种蛋白质的错误折叠强调，包括热休克^3,5,11,12。其次，Hsp104交叉β-淀粉样纤维的重塑使酵母利用无数的朊病 ​​毒（感染性淀粉样）和水库作为一个有益的遗传表^型变异13-22。值得注意的是，Hsp104直接重塑preamyloid低聚物和淀粉样纤维，包括酵母朊蛋白Sup35 ^和 Ure2 23-30组成的。这淀粉样蛋白重塑的功能是专业方面的酵母Hsp104。的大肠杆菌大肠杆菌同源，ClpB，无法改造preamyloid低聚物或淀粉样纤维^26,31,32。

Hsp104同源除外，令人困惑，动物王国的生活。事实上，无论是动物细胞中拥有任何酶系统，夫妻蛋白复性（而不是退化）的分类仍然是^未知 33-35 。因此，我们和其他人提出，Hsp104可能会被视为一个与特定的蛋白质错误折叠成有毒的preamyloid低聚物和淀粉样^纤维 4,7,23,36-38有关的各种神经退行性疾病的治疗剂开发。有没有直接目标与这些疾病有关的汇总物种的治疗。然而，Hsp104溶解毒性低聚物和淀粉样纤维的α-突触核蛋白，这是帕金森氏病²³以及³⁹的PrP淀粉样蛋白形式相连组成。更重要的是，Hsp104减少蛋白质聚集和改善^帕金森氏病23和^亨廷顿氏病38的老鼠模型的神经退行性疾病。理想的情况下，优化治疗和减少副作用，Hsp104将设计和potentiated有选择性地改造的核心问题^4,7的疾病的具体聚集。然而，有限的结构和机理的了解如何Hsp104分解聚合结构和不相关的蛋白质的这样一个多样化的剧目挫败^这些努力30,40-42。

要了解Hsp104的结构和机制，它是用最少的元件必须研究的纯蛋白质和重组其disaggregase活动。 Hsp104是一个102kDa蛋白与PI〜5.3，ADP或ATP，或在高蛋白质浓度在^43-46核苷酸的情况下hexamerizes。在这里，我们描述了一个优化的协议， 从 E的纯化高度活跃，稳定Hsp104 大肠杆菌 。 E.使用大肠杆菌可以简化大规模生产，我们的方法可以进行快速，可靠地为众多Hsp104变种。我们的协议，增加Hsp104的纯度和简化_他的6个标签去除，相比以前的提纯方法从E. 大肠杆菌 ^47。此外，我们的协议是两个较近期的^协议 26,48比更轻便和方便。

研究方案

1。对Hsp104的表达

1. 质粒在大肠杆菌中聘用为净化大肠杆菌 ，pPROEX HTB - Hsp104，包含的trc启动子的^诱导 26控制下Hsp104开放阅读框。质粒产生的N -端他的_6个标签，可删除TEV蛋白酶裂解Hsp104。转换成密码子优化E. pPROEX HTB - Hsp104 大肠杆菌 BL21 CodonPlus的RIL细胞（Stratagene公司，安捷伦科技公司）使用一个典型的细菌转化过程（例如按照制造商的指示）。重要的是要使用一个密码子优化的E.菌株 ，因为Hsp104有一个不寻常的密码子的偏见。
2. 接种（USB.方药：16克/ L，酪蛋白胨，10G / L酵母提取物，5克/ L的NaCl，pH值7.0），辅以新鲜转化100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素一个100毫升2XYT文化和成长一夜之间在37 ° C在200rpm摇晃。
3. 过夜培养，接种到6 X 1L100μg/mL氨苄青霉素和34μg/mL氯霉素2XYT在2L烧瓶10ML。在250rpm摇在37 ° C，直到OD ₆₀₀ = 0.4-0.6。停止震动和降低温度至15 ° C。允许细胞以平衡为30min unagitated在孵化器，直到它到达15 ° C。一旦15 ° C时达到诱导蛋白的表达，加入IPTG至终浓度为1mm。继续晃动在250rpm过夜（12-16小时）。

2。细胞收获和裂解

1. 为20分钟4000转离心收集细胞（在预冷转子）在4 ° C（我们使用一个Sorvall RC 3BP +离心机）。后续步骤必须立即执行，因为Hsp104活动减少时，大肠杆菌大肠杆菌细胞被冻结。此外，所有的后续步骤，应在冰上或4℃
2. 在prechilled悬浮细胞球（冰）10毫升裂解液（40MM的HEPES - KOH pH值7.4，500mm的氯化钾，氯化镁20MM _{2，2.5％（W} / V）甘油，20MM咪唑，5μM胃酶抑素A，完整的蛋白酶抑制剂的鸡尾酒（1 EDTA的免费tablet/50mL），和2mm的β-巯基乙醇）。
3. 一位法国记者（Emulsiflex）使用热交换器，浸泡在冰水中匀浆，裂解细胞。在使用之前，确保所有细胞团块已溶解。平衡与裂解缓冲液匀浆后，通过15,000-18,000 psi的压力缸的传递是足够充分溶解。如果一个法国媒体不可用，通过超声与溶菌酶的潜伏期可以使用（见讨论）。保存一个小样本的裂解细胞，SDS - PAGE分析（1μL）（图2中的裂解液）。
4. 细胞碎片取出离心20分钟16,000转，4 ° C（我们使用一个Sorvall RC5C + centifuge）。保留上清液为下一步并保存为一个小样本的上清液（1μL）SDS - PAGE分析（镍负载图2）。

3。 Hsp104净化

1. 从步骤2.4混合上清液12mL（2ML镍琼脂糖珠，每细胞1L）50％的裂解液平衡的镍琼脂糖凝胶珠（GE）的泥浆。
2. 3个小时的样品慢慢旋转4 ° C，镍琼脂糖凝胶均匀悬浮发泡最小化。更短的孵育时间是可能的，但会减少产量。在4 ° C在蛋白酶抑制剂的存在，小的退化发生，和3个小时的镍琼脂糖凝胶孵化时间不会降低最终产品的活动。收集镍琼脂糖离心2分钟，在4 °在2000彗星RPM（的Eppendorf 5810R离心机）。保存一个小样本上清进行SDS - PAGE分析（1μL），并丢弃其余的（镍流经（FT）在图2）。
3. 洗洗涤缓冲液（40MM HEPES - KOH pH值7.4，150mm的氯化钾，氯化镁₂ 20MM，2.5％（W / V）甘油，20MM咪唑，2mm的β-巯基乙醇），5倍柱体积的25倍柱体积的提取镍琼脂糖凝胶用1M KCl的缓冲，以消除静电绑定到Hsp104的污染物，25柱体积的缓冲液洗。镍琼脂糖收集每个离心洗2分钟后，4 °在2000彗星RPM（的Eppendorf 5810R离心机）。每个洗，离心循环后，吸删除缓冲区。
4. 洗脱1ML洗脱缓冲液制成每1ml镍琼脂糖（40MM HEPES - KOH pH值7.4，150mm的氯化钾，氯化镁₂ 20MM，2.5％（W / V）甘油，350MM咪唑，2mm的β-巯基乙醇）和Hsp104，混合镍琼脂糖凝胶在4 ° C 20分钟旋转。咪唑浓度高破坏的倪珠他₆互动。镍琼脂糖凝胶取出空的1.2毫升离心柱（BIO - RAD）离心2分钟4 °在2,000 RPM（的Eppendorf 5810R离心机）彗星。保存洗脱液SDS - PAGE分析1μL（倪洗脱液图2）。 〜15毫克的Hsp104是每公升的细胞，在这一步获得。
5. 采用截留分子量为30,000 Amicon超（MIL缓冲区交换到缓冲区问（20MM的Tris - HCl pH值8，0.5mm的EDTA，MgCl _2的 5MM，50MM氯化钠）洗脱液lipore）15ML离心选矿单位。首先，集中〜1.5ml的蛋白质，再加入14.5mL缓冲Q来稀释10倍的蛋白质。缓冲交换，重复3次。增加的pH值和低盐，确保Hsp104具有较高的负电荷。
6. 净化Hsp104通过阴离子交换色谱法，使用一个缓冲Q平衡资源Q 6ML列（GE）。注射前，蛋白质进行筛选，通过低蛋白具有约束力的Millex GP PES膜0.22μm的注射器过滤器（Millipore公司）。我们聘请的为1ml/min的流速。洗去弱结合蛋白1柱体积的20％，缓冲区Q +（20毫米的Tris - HCl pH值8，EDTA的0.5MM，5MM氯化镁_2，1M氯化钠）。洗脱Hsp104超过5倍柱体积与线性渐变（20％-50％Q +缓冲）（图3）。收集1毫升分数。 Hsp104和大多数变种通常〜400mm的氯化钠（31mS/cm）洗脱。保存样品的SDS - PAGE分析（图3，插图）的最高分数为（1μL）。
7. 为了消除他的_6个标签，使用Amicon离心选矿机的交换蛋白上面描述（见第3.5步）进入裂解缓冲液（20MM的HEPES - KOH pH值7.4，140mm的氯化钾，和_10mm氯化镁2 ）。根据制造商的说明使用proTEV蛋白酶（Promega公司）或AcTEV蛋白酶（Invitrogen公司）。 Hsp104，我们发现，比例较高的TEV蛋白酶：Hsp104充分裂解。我们使用了1％12μgHsp104蛋白酶单位的比例。应在30 ° C卵裂为2-4小时，16小时的潜伏期在4 ° C。最后Hsp104浓度应介于20 -75μm的单体。加入过量的镍琼脂糖凝胶的Hsp104在裂解反应量（假设珠可以绑定15毫克每毫升包装树脂的蛋白质）消耗任何His6标签的​​剩余Hsp104镍琼脂糖凝胶（GE）和TEV蛋白酶。删除珠空离心柱（BIO - RAD）在2分钟2,000转离心4 ° C。 SDS - PAGE分析裂解（1μL）之前和之后收集的样本，以确保乳沟，uncleaved蛋白质的去除（图4）。
8. 兑换成体积排阻采用截留分子量为30,000 Amicon超（Millipore公司），在步骤3.5中所述的缓冲区（20MM的HEPES - KOH pH值7.4，氯化钾_140MM，10MM氯化镁2，EDTA的0.1MM，1MM数码地面电视）。
9. 进一步净化Hsp104通过体积排阻色谱。使用体积排阻缓冲平衡Superose 6或Superdex 200柱（均来自GE）（图5）。注射前，蛋白质进行筛选，通过低蛋白具有约束力的Millex GP PES膜0.22μm的注射器过滤器（Millipore公司）。 10/300大小列（24mL）小于10毫克的蛋白质，可用于0.5毫升馏分收集。 12/60大小列（120ML）超过10毫克的样品，应使用1毫升馏分收集。请参阅制造商的流动速率和样品装入卷指示。经纯化后，Hsp104分数汇总，如图所示。 5和集中Amicon离心浓缩装置（Millipore公司）。 Hsp104存储，如下所述。由于分离Hsp104降解产物和污染物的最终产量的纯化全长Hsp104〜1 - 3mg的每开始文化公升的物质损失。

4。 Hsp104 Disaggregase活动

1. 净化后，它是很好的做法，在分类检测评估Hsp104活动。通常情况下，我们采用荧光素酶的激活检测（图6） 。在这个实验中，结合与HSP70的伴侣系统（Hsp70和Hsp40）分解尿素变性的萤火虫荧光素^酶聚合2 Hsp104。可溶性的荧光素酶催化氧化荧光素oxyluciferin，反应，释放光。通过监测发光，相对激活，因此分类，荧光素酶才能确定。 Hsp104必须能够协同合作与HSP70的合作伴侣系统。恢复发光量取决于确切的热休克蛋白70：Hsp40对利用。我们经常聘请HSP72和Hsp40（分析设计）。至少，积极Hsp104应该产生在荧光素酶的激活增加5倍，相比HSP72激活：Hsp40（图6）。 Hsp104的筹备工作，没有达到这个水平的活动都将被丢弃。

5。 Hsp104存储

1. 短期储存，Hsp104可以保持在4 ° C体积排阻缓冲区。然而，活动将下降2-3天之后，在4 ° C和1周后大幅4 ° C。对于分类分析，我们建议，Hsp104应采用净化后尽快。理想的情况下，Hsp104应立即使用淀粉样蛋白分解实验。
2. 如果蛋白质必须长期存储，Hsp104交换到存储缓冲区（20MM的HEPES - KOH pH值7.4，氯化钾140MM，10MM氯化镁_2，EDTA的0.1MM，1MM数码地面电视，10％甘油（W / V））。 100μL等分是液氮冷冻和储存在-80 ° C的管理单元冻融循环次数大大减少Hsp104活动应尽量避免。我们建议慢慢解冻冰Hsp104。 -淀粉样蛋白disaggregase的活性会大幅下降1个月后，在-80 ° C。

6。代表性的成果和数据：

图1。 Hsp104是一个双功能的disaggregase。无序聚集（左所示）进行分类，要求合作的HSP70的伴侣系统^（Hsp70和Hsp40）2。 Hsp104重塑下令没有援助，Hsp70和Hsp40 在体外淀粉样蛋白聚合体（如右图所示），但Hsp70和Hsp40可以提高对淀粉样蛋白^26,28 Hsp104活动。对于这两种类型的聚合结构，Hsp104夫妇ATP水解底物，通过其中央通道，以促进分类易位。从事酪氨酸轴承孔循环，并通过中央通道穿梭基板^49-52。

图2。镍亲和纯化步骤的SDS - PAGE电泳分析 。裂解液，镍，镍负载FT和镍洗脱液样品使用4-20％的Tris - HCl1.0毫米标准胶（BIO - RAD）和考马斯染色的SDS - PAGE分割。请注意，并非所有的Hsp104是能够绑定到镍琼脂糖。广泛分子量标记（BIO - RAD）（左线）。

图3。资源Q净化镍琼脂糖洗脱液在280nm处和绿线，蓝线代表的吸光度代表％缓冲区Q +（最高50％ ）。的第一个高峰，其中20％洗脱Q +含有杂质，降解产物和不当折叠Hsp104的。第二和主要峰包含正确折叠和活跃Hsp104。流速为1ml/min。从20-50％Q +梯度是30分钟或5倍柱体积。插图：峰组分经SDS - PAGE分析使用4-20％的Tris - HCl1.0毫米标准胶（BIO - RAD）和考马斯染色解决。广泛分子量标记（BIO - RAD）（左）所示。

图4。 proTEV蛋白酶裂解步骤SDS - PAGE分析 ，从资源Q净化_他的6 Hsp104治疗proTEV 4小时蛋白酶在30℃，然后16个小时，在4 ° C。样品经SDS - PAGE分次使用的4-20％的Tris - HCl1.0毫米标准胶（BIO - RAD）和考马斯染色。请注意，proTEV裂解Hsp104迁移更迅速。 TEV蛋白酶和uncleaved Hsp104已经所剩无几步骤3.7中所述的镍琼脂糖凝胶。广泛分子量标记（BIO - RAD）（左）所示。

图5。体积排阻Hsp104净化。劈开Hsp104是通过Superose 6凝胶过滤柱（10/300，GE）进一步纯化。流量= 0.4ml/min。峰之间的虚线代表汇集分数。插图：峰组分经SDS - PAGE分析使用4-20％的Tris - HCl1.0毫米标准胶（BIO - RAD）和考马斯染色解决。广泛分子量标记（BIO - RAD）（左）所示。

图6。荧光素酶的激活检测 。变性萤火虫荧光素酶聚合（50纳米）与HSP72和Hsp40（1μM）（含量设计），Hsp104（6μM单体）或Hsp104，HSP72和90分钟Hsp40在25 ° C孵育变性荧光素酶只有充分激活Hsp104和Hsp40/Hsp72存在。恢复发光，是衡量一个无限M1000酶标仪（TECAN）。价值观代表表示± SEM（N = 3）。

讨论

时间轴：最大的Hsp104活动中，我们建议尽可能迅速完成整个净化计 ​​划。然而，纯化步骤，使一个苛刻的时间表，可能并不总是实际的。如果净化步骤是尽快地进行，时间从隔夜表达年底通过孵化2-4小时30 ° C是与TEV蛋白酶约9-11小时。一个潜在的地方，暂停以下TEV裂解步骤。如果绝对必要的，Hsp104可能会被冻结这一步后，上文所述（步骤5.2）的管理单元。解冻后和纯化Hsp104然后必须立即?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂名称	公司	目录编号
感受态细胞BL21 - CodonPlus - RIL	Stratagene公司，安捷伦科技公司	230255
2XYT肉汤	USB	75864
完成后，迷你型，EDTA无蛋白酶抑制剂药片	罗氏公司	1836170
胃酶抑素一个	西格玛	P4265
镍琼脂糖凝胶6快流	GE医疗集团	17-5318-02
Amicon超15离心式过滤器（截留分子量30,000）	Millipore公司	UFC903008
资源Q - 6毫升列	GE医疗集团	17-1179-01
proTEV蛋白酶	Promega公司	V6052
AcTEV蛋白酶	Invitrogen公司	12575015
Superose 6 10/300 GL	GE医疗集团	17-5172-01
Hsp40	检测设计	SPP - 400
HSP72	检测设计	ADI公司的NSP - 555